氯霉素单克隆抗体的制备与纯化

易 喻，汪竹环，朱克寅，李 敏，应国清

(1.浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014;2.杭州博林生物技术有限公司，浙江 杭州 310018)

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一种广谱性抗生素，对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有很好的抑制作用［1］。由于其优良的抗菌性和低廉的价格，因此常作为细菌性疾病的治疗药物应用于人和动物，并作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业和人工水产养殖业。但是，CAP具有毒性，易引起人体血中毒，长期应用可导致再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症。婴儿长期食用CAP污染的乳汁，可能会引起“灰婴综合征”［2-3］。此外长期微量摄入CAP，不仅使大肠杆菌、沙门氏菌等产生耐药性，而且会引起机体正常菌群失调，使人们易感染各种疾病［4］。如果CAP在食用动物中残留，可通过食物链传给人类，对人类的健康造成危害，因此，抗CAP单克隆抗体的制备对动物性食品中CAP的检测具有重要意义。本研究以纯化的CAP全抗原为免疫原，利用淋巴细胞融合技术，建立了能稳定分泌特异性抗CAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并对得到的单克隆抗体进行了纯化和鉴定，为动物性食品中 CAP的检测提供实验基础。

1 材料

SP2/0骨髓瘤细胞，南京凯基生物科技发展有限公司。

CAP，上海晶纯试剂有限公司;HAT培养液、HT培养液、PEG1500，Sigma公司;胎牛血清，民海生物工程有限公司;牛血清白蛋白(BSA)，上海生工生物工程有限公司;RPMI 1640培养液，吉诺生物医药技术有限公司;免疫原CAP-BSA和检测抗原CAPOVA，本实验室合成;羊抗小鼠 IgG-HRP，博士德生物工程有限公司。

BALB/c小鼠，浙江省动物实验中心，许可证:SCXK(沪)2008-0016;F1小鼠，浙江中医药大学动物实验中心，许可证:SCXK(沪)2007-0005。

2 方法

2.1 免疫

用纯化的CAP-BSA抗原淋巴注射6～8周龄的BALB/c小鼠，每次免疫量为100μg/只，第1次免疫与等量的弗式完全佐剂充分乳化，第2和第3次免疫与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化，每次间隔7d，融合前3 d腹腔直接注射抗原100μg加强免疫。

2.2 细胞融合

将小鼠处死，无菌摘取脾脏，研磨制取脾B淋巴细胞悬液，洗涤调整细胞浓度为(1～5)×107/mL。将免疫脾B淋巴细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞按 5∶1混合后离心弃上清，缓慢加入50%PEG1500溶液1mL，间隔1 min后，缓慢滴入无血清培养液，终止融合剂的作用，经洗涤去除融合剂后加入所需量的细胞培养液，分种于96孔培养板，每孔200μL，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养。

2.3 杂交瘤细胞的筛选

在选择HAT培养基中，骨髓瘤细胞是不能生长的，而只有骨髓瘤细胞与B淋巴细胞的融合细胞能增殖生长;此外，正常B淋巴细胞一般在培养情况下也是不能长期存活，因而被淘汰。在细胞融合24 h后，每孔加入HAT培养液，每3 d换液1/2 HAT选择培养液，经过2周的培养后，骨髓瘤细胞与B淋巴细胞的杂交瘤细胞即被选择培养出，然后进行单克隆化。

采用有限稀释法进行细胞单克隆化，按实验室常规方法操作，一般3～4次，直至克隆细胞生长的各个孔检测100%抗体阳性为止。

2.4 单克隆抗体的制备及其性质的鉴定

采取体内诱生法制备大量腹水。先腹腔注射液体石蜡0.5mL于F1小鼠，1周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10 d后可产生腹水，待腹水尽可能多，收集腹水，可反复收集数次。

间接竞争ELISA(ciELISA)筛选杂交瘤细胞。用包被液将CAP-OVA抗原稀释成一定浓度，1μg/孔包被酶标板，设置空白对照孔，37℃包被2 h;PBS-T溶液浸洗3次，每孔加入细胞上清液200μL，37℃孵育1 h;PBS-T溶液浸洗3次，每孔加入用BSA溶液按 1∶3 000稀释的羊抗小鼠 IgG-HRP 100μL，37℃孵育1 h;PBS-T溶液浸洗3次，双蒸水浸洗3次，每孔加入邻苯二胺底物溶液100μL，置于暗处反应5 min，阳性孔变为棕黄色，每孔加入2 mol/L H2SO4溶液100μL终止反应。筛选出的阳性孔再用CAP-OVA包被的酶标板进行竞争抑制性ELISA法，先将细胞培养上清与2×10－3mol/L的CAP溶液等量混合，37℃作用1 h，再加入已包被的酶标板中。同时用0.01 mol/L，pH 7.4的PBS替代CAP溶液作对照。若经抑制后的A490降至对照孔50%以下，则判为阳性孔。

2.5 抗体的纯化

选择5mL HiTrap r-Protein A FF预装色谱柱纯化抗体。20mmol/L磷酸缓冲液上样，用0.1 mol/L甘氨酸缓冲液洗脱。考察选择上样缓冲液的pH和NaCl浓度、洗脱液的pH对抗体纯化的影响［5］。

SDS-PAGE鉴定单克隆抗体的纯度和回收率。分离胶浓度12%，浓缩胶浓度4%，还原状态下处理样品，电泳后以考马斯亮蓝R250染色，乙醇乙酸脱色，直至背景脱净为止，然后经凝胶成像系统扫描并分析，鉴定其纯度和回收率。

2.6 单克隆抗体特异性的测定

用ciELISA法测定纯化后抗体与BSA、甲砜霉素以及磺二甲基嘧啶之间的交叉反应，用BSA、甲砜霉素、磺二甲基嘧啶等稀释液替代CAP稀释液，其他条件相同。以50%抑制的CAP浓度与50%抑制的类似物浓度之比为其交叉反应率。交叉反应率=(50%抑制的CAP浓度/50%抑制的类似物浓度)×100%。交叉反应率的大小了反应了抗氯霉素单克隆抗体的特异性［6］。

3 结果

3.1 杂交瘤细胞株的建立

3.1.1 小鼠血清抗体效价检测 CAP-BSA抗原免疫的BALB/c小鼠共4只，眼眶取血检测效价(表1)。4只小鼠的血清抗体效价都达到了10－6以上，免疫效果较好，可进行细胞融合。

表1 免疫小鼠血清抗体效价Tab.1 Antibody titers in the sera of the mice immunized with CAP-BSA

3.1.2 杂交瘤细胞株的建立 细胞融合后经HAT培养液筛选后以及间接ELISA检测，测出9个阳性孔，取上清效价最高(10－4)的两孔细胞株(1D1，3G12)采用有限稀释法单克隆化4次，从表2看出，第2，3，4次单克隆时，2株细胞的阳性率均为100%。杂交瘤细胞株经14周的培养后依旧能稳定分泌单克隆抗体。经液氮冻存、复苏后，两株细胞系仍能稳定分泌特异性抗CAP抗体。

表2 2株杂交瘤细胞株单克隆化实验结果Tab.2 Result of hybridoma cell cloning of 2 hybridoma cells

3.2 单克隆抗体的制备及其性质的鉴定

3.2.1 杂交瘤细胞上清蛋白含量及抗体效价的检测 细胞上清抗体效价达到了10－4以上(表3)。

3.2.2 腹水蛋白含量及抗体效价的检测 2株杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔均能产生较高浓度的蛋白，且抗体效价均在10－7以上(表3)。

3.3 抗体的纯化

在上样缓冲液pH 6.5，7.0，7.5 条件下，单抗均能保留在色谱介质上。在pH 7.0的上样条件下，洗脱的目的蛋白峰中杂蛋白含量较少，而且抗体在中性条件下也最为稳定，所以确定pH 7.0为上样的最佳pH。

上样缓冲液中NaCl的浓度达4 mol/L以上时达到了其溶解度产生盐析效应，从而影响抗体的稳定性。当NaCl浓度在0～3.0 mol/L时，目的单抗均能较好地与色谱介质结合，在NaCl浓度为3.0 mol/L时，洗脱的目的蛋白峰中杂蛋白含量较少，纯度较高。

表3 细胞上清和腹水中的蛋白含量及抗体效价Tab.3 Protein concentration and antibody titer of cell culture supernate and obtained ascites

0.1 mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液作为洗脱液，进行一步洗脱。pH 值为2.5，3.0和3.5，实验结果表明均能很好地将目的抗体与杂蛋白进行分离，随着pH的增加，分辨率逐步提高，最后将抗体峰和杂蛋白峰彻底分开。目的抗体的纯度大于95%。但随着pH的增加，抗体的回收率也有所下降。因此，确定pH 3.0的0.1 mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液作为洗脱液。

本实验确定pH 7.0，20 mmol/L磷酸缓冲液(含3.0 mol/L NaCl)为最佳上样条件;pH 3.0，0.1 mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液为最佳洗脱条件。经凝胶成像系统分析可知，抗体纯度可以达到98%，回收率可达80%，抗体的生物学活性良好。色谱结果如图1所示。电泳鉴定结果如图2所示。

图1 mAb在r-Protein A亲和色谱柱上色谱图Fig.1 Chromatogram of mAb by using HiTrap r-Protein A FF

3.4 单克隆抗体特异性测定

采用ciELISA法测定交叉反应结果见表4，表明单克隆抗体1D1和3G12与BSA、甲砜霉素以及磺二甲基嘧啶均无交叉反应，这说明单克隆抗体1D1和3G12具有较高的特异性。

图2 mAb在r-protein A亲和色谱柱上纯化电泳图Fig.2 SDS-PAGEof mAb purified by using HiTrap r-Protein A FF

表4 单克隆抗体1D1和3G12的交叉反应性Tab.4 Cross-reactivity(CR50%)of monoclonalantibody 1D1 and 3G12

4 讨论

在制备CAP单克隆抗体的过程中，由于CAP(相对分子质量为323)是一种半抗原，本身不具备免疫原性，所以需要将其与大分子载体物质(蛋白质)相偶联成完全抗原，免疫动物时才能刺激机体产生免疫应答。本文采用自制的CAP-BSA免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，经反复筛选和单克隆化后得到了2株稳定分泌单克隆抗体细胞株。而且交叉反应结果表明所获得的2株细胞分泌的单克隆抗体与BSA，甲砜霉素以及磺二甲基嘧啶均没有交叉反应性。CAP与BSA无交叉反应，说明在免疫应答反应中只有CAP参与了免疫应答反应。而且CAP在结构上和甲砜霉素的区别在于CAP的对位硝基被甲磺酰基取代，这进一步表明硝基在抗原-抗体反应中的作用［7］。这将为为动物性食品中CAP残留的检测打下基础。

本文采用重组蛋白A偶联的琼脂糖凝胶作为亲和介质的蛋白A亲和色谱纯化小鼠腹水来源的抗CAP单克隆抗体，分离效果良好，获得纯度高，特异性强，生物活性好的单抗，并且操作简便，快速，重复性好，色谱柱可反复多次使用，为今后单抗的纯化提供了简单、有效的方法。

［1］Meyer L.Blood dyscrasias attributed to chloramphenicol:A review of 641 publised and unpublished cases［J］.Postgrad Med，1974，50:123-126.

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［4］王桂枝，石德时，毕丁仁，等.氯霉素免疫原的合成与鉴定［J］.中国兽医学报，1998(2):163-167.

［5］沈 泓，易 喻，应国清，等.人绒促性腺素单克隆抗体的制备与分离纯化［J］.中国生化药物杂志，2010，31(1):22-24.

［6］Gao A Z.Preparation of monoclonal antibodies against a derivative of semicarbazide as a metabolic target of nitrofurazone［J］.Anal Chim Acta，2007，592(1):58-63.

［7］Rüdiger H，Erwin M，Gerhard T.Production and characterization of a monoclonal antibody to chloramphenicol［J］.Food Agri Immunol，1989(1):197-201.