E838对再生障碍性贫血小鼠造血功能的治疗作用

张 恒，王月英，李德冠，王小春，路 璐，吴红英，常建辉，翟志斌，孟爱民

(北京协和医学院 中国医学科学院 放射医学研究所 天津市分子核医学重点实验室，天津 300192)

再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)是由于生物、化学、物理等因素导致造血组织功能减退或衰竭而引起全血细胞减少，临床表现为贫血、感染、出血等症状的一组综合征，是造血系统比较常见的疾病［1］。目前临床上广泛使用的治疗方法都存在缺点，如雄激素法对改善血小板效果不佳且副作用大，骨髓移植法配型困难且远期免疫抑制剂使用成本高，免疫抑制剂法成本高且远期并发症严重;开发安全、有效、成本低的AA治疗方法具有良好的临床应用前景。

E838(17a-D-高炔雌二醇-3-乙酯)是我们对炔雌醇结构进行改造合成的一种新型雌激素类化合物，分子式为C23H28O3，相对分子质量352。我们研究小组前期研究表明，E838、炔雌醇、尼尔雌醇、雌三醇等雌激素类物质对放疗、化疗导致的造血系统损伤具有一定的防护作用［2］，其中E838的防护作用最强、雌激素活性最低［3］，在放化疗病人恢复造血机能的临床应用上具有良好前景。在本项研究中，我们改进了Barnes的经典造模方法［4］，采用电离辐射和免疫介导结合的方法诱导小鼠AA模型并用E838进行干预，考察外周血常规、网织红细胞(Reticulocyte，Ret)计数和骨髓病理等多项指标，评估AA动物模型的有效性和E838对AA的治疗作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

近交系BALB/c小鼠30只，体重20～22 g，雄性，由中国辐射防护研究院提供，合格证号:SCXK(京)2007-0001;近交系DBA/2小鼠2只，体重22～24 g，雄性，由中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号:SCXK(京)2005-0013。饲料为清洁级全价鼠料，由北京科奥协力饲料有限公司提供。

1.2 试剂及仪器

E838为我所自行制备;注射用茶油，天津氨基酸公司生产，配制E838使用液，浓度为750μg/mL。

pocH-100i自动血细胞计数仪，日本希森美康株式会社;BX51正置显微镜，日本奥林巴斯公司;RM2235石蜡切片机，德国莱卡公司。

1.3 照射条件

天津市物理技术研究所60Co源γ射线，剂量为5.0 Gy，剂量率为1.1 Gy/min。

1.4 方法

1.4.1 动物分组 取生长良好的BALB/c小鼠30只，随机分为3组，每组10只，即对照组、AA模型组(AA组)、E838干预组(E838组)。

1.4.2 动物处理 对照组进行假照射，AA组、E838组进行全身照射;AA组、E838组小鼠参考Barnes方法［4］建立AA动物模型;E838组小鼠建模后给E838茶油溶液进行干预实验。

1.4.3 给药方式 E838组剂量为75μg(0.1mL)/只，制备模型当天灌胃给药，其余各组小鼠给予等体积茶油，1次/d，连续14 d。

1.5 指标测定

1.5.1 一般生长状态观察 包括一般行为、毛发、出血点及死亡情况。

1.5.2 外周血常规参数测定模型制备至第15天，小鼠称重，眼球取血200μL，EDTA-K3抗凝，用自动血细胞计数仪测定外周血白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)、血小板计数(PLT)等指标。

1.5.3 Ret计数 眼球取血100μL，加入1%煌焦油蓝溶液50μL，混匀放入37℃水浴锅中染色15 min，取出后推片，再进行瑞氏染色，油镜下计数1 000个红细胞中的Ret。

1.5.4 骨髓有核细胞计数 处死小鼠，取小鼠左侧股骨，用冲洗液2mL冲出骨髓，在血细胞计数仪上测定骨髓有核细胞数。

1.5.5 病理学观察 取小鼠右侧股骨，常规固定、脱水、脱钙、石蜡包埋，石蜡块用石蜡切片机制作5 μm切片，切片HE染色后用中性树脂封片，用正置显微镜进行组织学观察并采集图像。

1.6 统计学分析

所有资料处理用SPSS16.0版软件包进行分析，检测结果以(±s)表示，经Levene检验后，采用LSD法检验比较组间差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般生长状况

从第5天开始，AA组小鼠陆续出现活动减少、摄食减少，第8天出现腹部凹陷、体重下降等情况;E838组小鼠较AA组状况好，未出现腹部凹陷的情况，体重降低不明显;至第15天所有小鼠均未出现出血点及死亡现象。

2.2 外周血常规指标测定

外周血各项指标中(表1)AA组WBC、PLT、RBC、HGB水平均明显低于对照组(P＜0.05)。E838组与AA组相比，WBC高 163.8%，PLT高39.70%，RBC 高18.14%，HGB 高16.28%。

2.3 Ret计数

表1 E838对再障小鼠外周血的改善作用(±s，n=10)Tab.1 The therapeutic effect of E838 on peripheral blood of AA mice(±s，n=10)

表1 E838对再障小鼠外周血的改善作用(±s，n=10)Tab.1 The therapeutic effect of E838 on peripheral blood of AA mice(±s，n=10)

与对照组比较:1 P＜0.05;与AA组比较:2 P＜0.05Compared with control group:1 P＜0.05;Compared with irradiation group:2 P＜0.05

组 别 WBC/(109/L) RBC/(1012/L) HGB/(g/L) PLT/(109/L)Ret/‰对照组 6.30±0.36 8.74±0.98 145.0±12.1 1 016.4±88.1 86.2±10.7 AA 组 1.88±0.331 7.00±0.731 120.4±15.11 616.2±125.31 60.0±18.91 E838 组 4.96±0.212 8.27±1.172 140.0±20.6 860.8±94.72 140.5±24.12

经煌焦油蓝染色后镜下可见(图1)，AA组小鼠外周血Ret较对照组明显减少，E838组Ret水平高于其余各组(表1)。油镜下计数，AA组Ret比例较对照组低25.2%(P＜0.05)，E838组高于AA模型组134.2%(P＜0.05)。

图1 E838对再障小鼠Ret改善作用(1 000×)Fig.1 The ameliorated effect of E838 on reticulocytes of AA mice(1 000× )

2.4 骨髓有核细胞计数

结果见表2，再障模型组较对照组低51.8%(P＜0.05)，E838 组高于AA 模型组134.2%(P＜0.05)。

2.5 病理学检测

结果见图2。骨髓石蜡切片HE染色镜下观察，AA组与对照组比较，骨髓增生低下，造血组织显著减少，脂肪细胞增多，间质水肿，血窦扩张，有出血。E838组与AA比较，造血组织有所恢复，单核细胞增多，间质水肿少见，没有出血现象，脂肪细胞少于AA组。

表2 E838对AA小鼠骨髓单核细胞计数影响(±s，n=10)Tab.2 The ameliorated effect of E838 on BMMNCs of AA mice(±s，n=10)

表2 E838对AA小鼠骨髓单核细胞计数影响(±s，n=10)Tab.2 The ameliorated effect of E838 on BMMNCs of AA mice(±s，n=10)

与对照组比较:1 P＜0.05;与AA组比较:2P＜0.05Compared with control group:1P＜0.05;Compared with irradiation group:2P＜0.05

组 别 BMMNCs/(106/femur)对照组6.30±0.36 AA 组 1.88±0.331 E838 组 4.96±0.211，2

图2 E838治疗AA模型小鼠骨髓HE染色(100×)Fig.2 The HE staining of AA mice treated with E838(100× )

3 讨论

目前对构建AA动物模型的评估方法通常参照临床AA诊断标准，主要包括:(1)全血细胞减少，Ret绝对值减少;(2)骨髓象三系造血细胞至少二系明显减少;(3)骨髓造血组织明显减少，脂肪组织增生［4-6］。在本研究中，建模第15天AA模型组小鼠外周血RBC、PLT、RBC、HGB和Ret较对照组显著下降，符合建模要求。此外，骨髓有核细胞计数、骨髓病理HE染色结果也符合临床患者相关表现。综合分析表明，我们研究中构建的AA小鼠模型是成功的，进行相关药效学研究是可靠的。

在本研究中，E838组小鼠建模后灌胃给药共14 d，第15天对小鼠各项指标进行检测以验证E838是否具有治疗作用。外周血各项指标中，E838组WBC、RBC、PLT、Ret等指标均明显高于AA组(P＜0.05);其中Ret值提高明显，并高于对照组(P＜0.05)，提示E838干预小鼠的RBC、HGB还将进行性升高，骨髓单核细胞计数和骨髓病理检测均提示E838能有效恢复AA模型小鼠的造血组织机能。

据报道，有约70%AA患者免疫功能紊乱。CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)是具有免疫调节功能的细胞，AA患者外周血中Treg表达降低，分泌的细胞因子失衡，导致辅助性 T淋巴细胞Ⅰ型(Th1)数量增多，Thl/Th2比值升高，细胞免疫亢进、自身免疫耐受打破;同时体内Treg减少，抑制IL-2产生的能力下降，维持免疫耐受的能力降低，从而体内自身活化性T细胞大量增殖，体液免疫亢进，导致再障的发生。Polancayk等［7-8］研究发现在妊娠小鼠和经雌二醇处理的小鼠体内Foxp3表达加强，Treg细胞功能增强，其免疫抑制功能亦加强;Tai等［9］发现生理剂量的雌二醇可以刺激CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+T细胞转化，使不同组织中的Treg细胞增加，并增加Foxp3的表达;研究同时发现CD4+CD25-T细胞表面存在雌激素受体，而雌激素受体缺乏的动物Foxp3水平降低。以上证据表明，雌激素可能通过上调Treg功能抑制细胞免疫和体液免疫，降低自身免疫介导的造血抑制，提示E838改善AA动物模型造血功能可能是通过Treg介导的，但还需要进一步研究验证。

在本项研究中，我们成功构建了AA小鼠动物模型，并利用这一模型研究了E838对AA模型小鼠造血功能的治疗作用。我们推测E838对造血机能的恢复作用可能是由于其对Treg的上调而抑制了自身免疫介导的造血抑制，在今后的工作中我们将对这一假说进行研究，并研究其治疗作用其他可能的机制，为开发AA治疗药物提供新的靶点。

［1］Gaman A，Gaman G，Bold A.Acquired aplastic anemia:correlation between etiology，pathophysiology，bone marrow histology and prognosis factors［J］.Rom JMorphol Embryol，2009，50:669-674.

［2］王月英，李德冠，吴红英，等.E838及其联合放化疗对IRM-2小鼠自发淋巴瘤的抑制作用［J］.中国生化药物杂志，2010，31(3):154-157.

［3］王月英，王汝勤，赵忠萍.E838对小鼠辐射防护作用的研究［J］.中华放射医学与防护杂志，2005，25:39-40.

［4］Barnes D W，Mole R H.Aplastic anaemia in sublethally irradiated mice given allogeneic lymph node cells［J］.Br J Haematol，1967，13:482-491.

［5］Bloom M L，Wolk A G，Simon-Stoos KL，etal.A mouse model of lymphocyte infusion-induced bone marrow failure［J］.Exp Hematol，2004，32:1163-1172.

［6］刘 啸，祝彼得，徐 浩，等.再生障碍性贫血小鼠造模方法的实验研究［J］.甘肃中医学院学报，2004，21:17-19.

［7］Polanczyk M J，Carson B D，Subramanian S，etal.Cutting edge:estrogen drives expansion of the CD4+CD25+regulatory T cell compartment［J］.J Immunol，2004，173:2227-2230.

［8］Polanczyk M J，Hopke C，Huan J，etal.Enhanced FoxP3 expression and Treg cell function in pregnant and estrogen-treated mice［J］.JNeuroimmunol，2005，170:85-92.

［9］Tai P，Wang J，Jin H，etal.Induction of regulatory T cells by physiological level estrogen［J］.JCell Physiol，2008，214:456-464.