小刺猴头菌水溶性小分子提取物HPLC指纹图谱探讨

綦天华，丁石博，王再林，李雨庭，宋 慧

(吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118)

小刺猴头菌［Hericium caput-medusae(Bull:Fr.)Pers］具有提高机体耐缺氧能力，提高心血管输出量，加速血液循环，抑制肿瘤细胞生长等作用，尤其对胃黏膜有较好的保护作用。临床应用猴头菌属真菌的子实体及菌丝体提取物治疗消化性溃疡、萎缩性胃炎、肝炎及癌症辅助治疗均有较好效果，并且经临床验证无毒副作用［1］。猴头菌具有组织修复、增强细胞活力、抗癌、延年益寿和美容等功能。现在小刺猴头的应用主要体现在多糖方面，但发酵过程中除主体多糖外，还有一些小分子物质产生。本文旨在通过现行提取方法以及指纹图谱技术对小刺猴头菌质量控制提供方法和依据，也为提高发酵过程中产物得率提供技术支持［2-4］。

1 材料

小刺猴头菌以及猴头菌(白求恩医科大学药厂);甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。

LC-2010HT高效液相色谱仪(日本岛津);中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)(国家药典委员会)。

2 方法

2.1 菌丝体的制备

采用液体摇瓶培养制备。培养基(红糖4%、蛋白胨 0.3%、CuSO40.002%、ZnSO40.005%、VB10.01%)，分装于500mL锥形瓶中，每瓶200mL。

将选取的斜面培养基菌丝体用灭菌水2mL进行冲洗，将洗菌水接种于新配制的液体培养基中，接菌量0.5mL，转速125 r/min，培养温度26℃，培养周期12 d，在3～10 d这8 d(8个发酵时期)内，每天取样1次，过滤出菌丝体，待用。

2.2 色谱条件

色谱柱 C18色谱柱(Diamonsi 150 mm×4.6 mm)，LcSolution数据处理软件。由预试验得出结果，流动相:甲醇-水(25∶75)配制溶液，得到最适流动相;流速:1.0mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:254 nm;进样体积:10μL;记录时间:10 min。

2.3 供试品溶液的制备

取菌丝体，用水洗净，50℃烘干。将菌丝体干粉浸于水中，在80℃水浴浸提3 h，提取液经4层纱布热过滤后，合并滤液，3 000 r/min离心15 min，上清液浓缩至原来体积的1/3，用终浓度为95%乙醇沉淀多糖，4℃静置12 h，3 000 r/min离心15 min，保留上清。冷冻干燥，配制成0.1 g/mL浓度的溶液，0.45μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液。

2.4 精密度实验

取同一份供试品溶液，连续进样5次，对各共有峰保留时间及峰面积进行考察。

2.5 重复性实验

取同一样品5份，按2.2项下方法制备供试品溶液，每份进样1次，对各共有峰保留时间及峰面积进行考察。

2.6 稳定性实验

取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，6，8 h 进样，对各共有峰保留时间及峰面积进行考察。

2.7 菌丝体指纹图谱的建立［5］

分别吸取供试品溶液各10μL注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版(国家药典委员会)软件对各样品色谱图的原始数据文件进行分析，以8个发酵时期的样品菌丝体提取物的对照图谱(中位数法)作为对照模板，计算各色谱图的整体相似度，选取7个共有峰进行相似度计算。谱峰处理:手动谱峰匹配。

3 结果

3.1 HPLC色谱条件的优化

色谱条件的选择主要以流动相的浓度、流速、系统温度进行优化，流动相方面，将甲醇与水按一定浓度梯度进行配制，分别用20%，25%，30%甲醇对同一样品进行检测，通过比较分离度以及峰型的好坏，得出最适浓度为25%甲醇溶液(图1)，即甲醇-水(25∶75)。检测波长通过对样品紫外最大吸收波长230，254，280 nm进行比较，最后选择254 nm时出峰最多，且峰型较好(图2)。流速与系统温度方面，通过比较，最后得出了最适条件，流速1.0mL/min;系统温度分别比较30，40℃时对于结果的影响，结果(图3)表明，30℃时能使样品中各色谱峰的分离度到达良好且出峰最多。

3.2 样品处理条件的优化

对不同浓度提取溶剂、提取方法所得到的指纹图谱进行反复分析，结果选择以水为提取溶剂，采用热提法进行提取，所得到的信息量最多，更适合小分子物质反向HPLC指纹图谱研究［6-7］。

3.3 指纹图谱方法学研究结果

精密度实验结果表明相对保留时间RSD＜1%，相对峰面积RSD＜3%，说明精密度良好;重复性实验对各共有峰保留时间及峰面积进行考察，结果表明相对保留时间RSD＜1%，相对峰面积RSD＜3%，说明重复性良好;稳定性实验结果表明相对保留时间RSD＜1%，相对峰面积RSD＜3%，说明在8 h内，样品溶液稳定。

图1 不同流动相对小刺猴头检验的影响Fig.1 Different mobile phase concentration influence on Hericium caput-medusae detection

样品的测量结果表明，其小刺猴头菌丝体水体小分子全谱相似度分别为0.998，0.999，0.998，1.000，0.999，1.000，0.993，0.996，1.000，即 8 个时期的样品及对照峰相似度均在0.9以上(见表1)，指纹图谱保留时间、峰面积相似度(见表2)均符合质量要求。说明液体发酵在这一段时期内主要成分的变化很小，可近似看作不变，说明这一段时期内菌丝体的新陈代谢处于平衡状态，当我们在日常检验中得到的谱图与以上谱图近似时，便可确定发酵的平台期，也为发酵终点的判断提供依据。

图2 不同波长对小刺猴头检验的影响Fig.2 Different wavelength influences on Hericium caput-medusae detection

图3 不同温度对小刺猴头检验的影响Fig.3 Different time influence on Hericium caput-medusae detection

表1 小刺猴头菌丝体指纹图谱相似度Tab.1 Similarity of HPLC fingerprint of Hericium caput-medusae's mycelium

表2 小刺猴头菌丝体指纹图谱保留时间，峰面积相似度Tab.2 Similarity of retention time and area on HPLC fingerprint of Hericium caput-medusae's mycelium

3.4 指纹图谱的建立和辨认

对供试品溶液进行检测，测得不同发酵时期小刺猴头菌丝体提取物的HPLC色谱图(图4)、猴头菌丝体提取物的HPLC色谱图(图5)，对菌丝体提取物的HPLC色谱图进行解析，确定共有7个共有峰，通过图谱对比构建了菌丝体提取物的HPLC色谱图的指纹特征，作为判断发酵平台期的依据。

图4 小刺猴头菌8个不同发酵时期菌丝体提取物的HPLC指纹图谱Fig.4 HPLC fingerprint of the Hericium caput-medusae's eight different fermentation mycelia extracts

图5 猴头菌8个不同发酵时期菌丝体提取物的HPLC指纹图谱Fig.5 HPLC fingerprint of the Hericium erinaceum's eight different fermentation mycelia extracts

4 讨论

在小刺猴头菌的研究中，多糖的研究占主导地位，与其相对应的小分子部分也不容忽视，冯天保等［6-7］利用HPLC对中国被毛孢菌水溶性小分子进行构建指纹图谱，并描绘出该菌丝体水溶性小分子的特征谱图，认为该指纹分析可作为品质分析以及部分药用真菌小分子相似度分析的方法。本文旨在对小刺猴头菌水溶性小分子的复杂成分进行定量定性分析提供依据，通过对小刺猴头菌及其同属的猴头菌菌丝体水溶性小分子指纹图谱进行对比最终描述出小刺猴头菌水溶性小分子提取物的色谱特征，说明水溶性小分子可以反映出小刺猴头菌的色谱特征，也可较好的反映出这8个发酵时期的水溶性小分子的相似关系，希望该方法能够作为作为区分不同种真菌的方法，也希望该法可作为部分药用真菌水溶性小分子指纹分析和品质控制的候选方法。

［1］王晓玉，蒋秋燕，凌沛学，等.猴头菌活性成分及药理作用研究进展［J］.中国生化药物杂志，2010，31(1):70-72.

［2］张 松，徐章荫.多糖类医药生物活性进展［J］.中国生化药物杂志，1996，17(6):272-275.

［3］曹瑞敏，王志才，苗人培，等.猴头菌中部分脂肪酸和微量元素分析［J］白求恩医科大学学报，1996(3):243-244.

［4］崔建国，黄燕敏，何小玉，等.多羟基甾醇的合成(Ⅳ):20-亚甲基-4-孕烯-3β，6β-二醇的制备及其抗肿瘤活性研究［J］.广西科学，2004(1):45-48.

［5］谢培山.中药色谱指纹图谱鉴别的概念、属性、技术与应用［J］.中国中药杂志，2001，26(10):653-655.

［6］冯天保.中国被毛孢菌丝体水提物质量分析与控制方法研究［D］.上海:上海师范大学，2009.

［7］冯天保，杨晓彤，糜 可，等.药用真菌子实体多糖SEC-HPLC图谱的相似度定量评价研究［J］.现代生物医学进展，2009，9(7):201-204.