HPLC法测定化妆品原料2-羟乙基脲及杂质尿素的含量

蒋亚奇，李启艳，林钰镓，李俊婕，高天阳，胡德福，于海英

(山东省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局化妆品原料质量控制重点实验室，山东 济南 250101)

2-羟乙基脲，又名β-羟乙基脲、羟乙基脲，由乙醇胺和尿素反应合成[1]，收录于2014年公布的《已使用化妆品原料名称目录》中，常作为保湿剂添加到化妆品中[2-3]。目前，化妆品原料2-羟乙基脲并无统一规范的质量标准，造成了市场上该原料在品质、含量等方面参差不齐，而尿素作为原料2-羟乙基脲中的常见杂质，其含量也会影响原料的品质，为化妆品原料的安全性和功效性带来风险隐患，因此，亟须制定化妆品原料2-羟乙基脲的质量标准，并控制其杂质尿素的含量。经文献调研，国内外对2-羟乙基脲的研究报道较少，尿素的测定方法主要有滴定法[4-6]、红外光谱法[7]、高效液相色谱(HPLC)法[8-10]，滴定法不适用同时测定2-羟乙基脲和尿素，红外光谱法更侧重于鉴别，现有的HPLC法中尚未见2-羟乙基脲和尿素同时测定方面的研究，鉴于此，本文采用HPLC法，建立了化妆品原料2-羟乙基脲及杂质尿素的含量测定方法，以实现对化妆品原料2-羟乙基脲的质量控制。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂 LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Sartorius CP225D电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；TU-1901紫外可见分光光度计(北京普析通用公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2-羟乙基脲(纯度99.5%，TCI公司)；尿素(纯度98.5%，上海安谱实验科技股份有限公司)；3批样品由无限极(中国)有限公司提供，样品编号为S1～S3(自编)。甲醇(HPLC级，美国Fisher Scientific公司)；乙腈(HPLC级，美国Honeywell公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Capcell PAK ADME C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；柱温：30 ℃；流动相：水，流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长：194 nm。

1.2.2 混合标准溶液的配制 精密称取2-羟乙基脲11.74 mg、尿素20.96 mg，置于同一10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，作为混合标准溶液。

1.2.3 样品溶液的制备 准确称取样品约0.2 g于100 mL容量瓶中，加乙腈适量，超声提取15 min，用乙腈定容至刻度，摇匀，精密吸取1.0 mL，置25 mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度，摇匀。经0.45 μm 滤膜过滤，取续滤液，作为样品溶液。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择 本文考察了以水、甲醇、乙腈作为提取溶剂的提取效果，结果发现，2-羟乙基脲和尿素均易溶于水、甲醇、乙腈，但尿素在水中易发生水解反应，稳定性较差，甲醇的截止波长较大，对测定易产生干扰，故选择截止波长较小的乙腈为提取溶剂。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 最大吸收波长的选择 用乙腈配制适当浓度的2-羟乙基脲标准溶液，进行紫外光谱扫描，结果见图1，由图1可知，2-羟乙基脲的最大吸收波长为194 nm，在此波长下，尿素也有较强的紫外吸收，因此确定为测定波长。

图1 2-羟乙基脲的光谱扫描图谱

2.2.2 色谱柱的选择 2-羟乙基脲和尿素均为强极性化合物，在常用的C18色谱柱中不易保留，出峰时间很短，本文分别考察了可耐纯水相的Agilent Zorbax Extend C18、Thermo Hypersil GOLD aQ C18和Capcell PAK ADME C18色谱柱，结果发现，2-羟乙基脲和尿素在Capcell PAK ADME C18柱上分离效果较好，该色谱柱键合了笼状金刚烷基，对强极性化合物具有良好的保留和分离能力，因此选为实验用色谱柱。

2.2.3 流动相的考察 本研究分别考察了以甲醇、乙腈、水及不同比例的甲醇-水、乙腈-水为流动相，结果发现，流动相中添加有机相会直接造成2-羟乙基脲和尿素的保留时间太小，无法有效分离，故选择以水为流动相，增大了保留时间，实现了待测成分的良好分离。

2.3 系统适应性试验 精密吸取混合标准溶液、样品溶液和空白溶剂(乙腈)各10 μL，按“1.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，结果见图2。由图2可知，在主峰附近无干扰，该色谱条件满足测定要求。

1.尿素；2.2-羟乙基脲图2 系统适应性试验结果

2.4 线性和范围 分别精密吸取混合标准溶液适量，用乙腈稀释成标准系列溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以标准系列溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见表1，由表1可知，2-羟乙基脲和尿素在各自的范围内线性关系良好。

表1 线性和范围

2.5 精密度试验 精密吸取混合标准溶液10 μL，按“1.2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。计算2-羟乙基脲和尿素的峰面积RSD分别为0.7%、0.5%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取混合标准溶液，分别在放置0、2、6、12、24、48 h分别进样10 μL，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，计算2-羟乙基脲和尿素的峰面积RSD分别为1.3%、0.8%，表明2-羟乙基脲和尿素在48 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验 平行称取同一样品6份，按“1.2.2”项下制备样品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算样品中2-羟乙基脲和尿素的含量和6份平行结果的RSD，结果见表2，由表2可知，方法重复性良好。

表2 重复性试验结果表(n=6)

2.9 检出限(LOD)和定量限(LOQ) 精密量取混合标准溶液，用乙腈稀释适当倍数，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算信噪比(S/N)，以S/N≈3的标准溶液浓度作为检出限，以S/N≈10的标准溶液浓度作为定量限。试验结果：2-羟乙基脲和尿素的检出限分别为0.12 μg·mL-1和0.21 μg·mL-1定量限分别为0.36 μg·mL-1和0.52 μg·mL-1。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一样品约0.1 g，共9份，分别置于100 mL容量瓶中，加入低、中、高3个水平的2-羟乙基脲和尿素标准品各3份，按“1.2.2”项下制备样品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算回收率和RSD，结果见表3和表4。由表3可知，2-羟乙基脲的平均回收率为98.0%，RSD为1.6%，由表4可知，尿素的平均回收率为97.1%，RSD为1.5%，表明方法准确度良好。

表3 2-羟乙基脲回收率试验结果表(n=9)

表4 尿素回收率试验结果表(n=9)

2.10 样品测定 取3批样品，分别按“1.2.2”项下制备样品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进样测定，以外标法计算样品中2-羟乙基脲和尿素的含量，结果见表5。

表5 样品含量测定结果(n=3)

3 结论

本研究建立了化妆品原料2-羟乙基脲及杂质尿素的HPLC含量测定方法，该方法准确度高，重复性好，检测灵敏度符合检测要求，色谱条件稳定，可作为化妆品原料2-羟乙基脲的含量测定方法，也可为该原料的质量标准研究提供参考。目前，有关2-羟乙基脲的研究较少，随着该原料在化妆品中的普遍应用，应加强2-羟乙基脲的原料质量标准、毒理学等方面的研究，为消费者安全使用提供保障。