基于网络药理学探讨调神攻坚汤治疗肝纤维化的作用机制

林慧，葛茂旭

(山东大学齐鲁医院，山东 济南 250012)

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是肝脏对各类损伤因素(如酗酒、自身免疫反应、病毒感染和胆汁淤积性等)的病理性修复反应，持续的肝损伤使细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝脏中弥漫性过度沉积与异常分布，进而导致纤维性瘢痕形成[1-3]。若不积极干预治疗，肝脏结构被纤维瘢痕持续破坏，导致肝脏正常功能失调，将进一步发展为肝硬化，甚至是肝衰竭或者原发性肝癌[4-5]。肝纤维化的过程是可逆的，即使在肝硬化晚期进行干预也可以改善患者预后[6]；但目前该病尚缺乏有效的治疗手段[7]。而中医药因其辨证论治和整体观念的特点，在抗肝纤维化方面有独特的优势，通过对传统方剂的探索可能为肝纤维化治疗提供新的思路[8]。

几千年来，许多中医方剂被广泛应用于临床治疗肝纤维化[9-10]。调神攻坚汤方出自《千家妙方》，方以柴胡为主药，疏肝理气，条达郁滞；配以黄芩泄肝火，抑少阳；苏子、陈皮、全瓜蒌行气化痰，开结消痞；石膏、夏枯草清热泻火；川椒止痛散结；白芍、甘草柔肝敛阴，缓急和络；王不留行破血逐瘀、削坚消积；牡蛎成以软化坚结；党参、大枣益气扶正，健脾助运。全方共奏疏肝、泄肝、柔肝、养肝、调肝、扶正抑木之效，最终达到疏肝理气，攻坚破瘀的功效。此方剂传统用来治疗乳腺癌，考虑到乳腺癌与肝纤维化等病均有淤节等症候，我们猜测调神攻坚汤有治疗肝纤维化的作用。

由于中药具有多组分、多靶点、多通路的复杂性，单纯依靠传统的药理学评价，难以确定中药复方的作用机制[11]。随着生物信息学和分子生物学的快速发展，基于网络药理学的分析为揭示中药方剂的复杂作用机制提供了新的方法[12-13]。本研究通过网络药理学验证了调神攻坚汤有治疗肝纤维化的作用，筛选调神攻坚汤对抗肝纤维化作用的有效成分、作用靶点、通路，对其抗肝纤维化的可能作用机制进行探索和阐释，为后续进一步开展调神攻坚汤治疗肝纤维化的相关研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 网站数据库和分析软件 中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)(https://www.tcmsp-e.com)；BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)；OMIM数据库(http://www.omim.org/)；Genecards 数据库(https://www.genecards.org/)； Cytoscape 3.7.2软件;STRING数据库(https://string-db.org)；Metascape网络分析平台(metascape.org/gp/index)；KEGG数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.kegg.jp/)。

1.2 方法

1.2.1 筛选调神攻坚汤有效成分和作用靶点 通过TCMSP数据库，设置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18和细胞渗透性(Caco-2)≥0.4作为检索条件进行筛选，对于TCMSP数据库无靶点的活性成分使用BATMAN-TCM数据库预测其作用靶点，最终获得调神攻坚汤(柴胡、黄芩、苏子、陈皮、全瓜蒌、石膏、夏枯草、川椒、白芍、甘草、王不留行、牡蛎、党参、大枣)所有符合条件的有效活性成分和可能作用靶点[14-16]。

1.2.2 获取肝纤维化的靶点及调神攻坚汤抗纤维化的作用靶点 以“liver fibrosis”“hepatic fibrosis”作为关键词，通过OMIM数据库和Genecards数据库进行检索，将两个数据库结果合并、删除重复项后得到肝纤维化治疗靶点[17]。

1.2.3 构建调神攻坚汤可视化调控网络图 使用R语言筛选调神攻坚汤与肝纤维化的共同靶点并绘制韦恩图；利用 Cytoscape 软件构建“药物-有效活性成分-疾病靶点”可视化调控网络图[18]。

1.2.4 构建蛋白质相互作用网络(PPI)及筛选核心蛋白 将上述共同靶点导入STRING数据库，构建PPI；利用 Cytoscape 软件中的Cytohubba插件通过MCC算法筛选核心蛋白，并提取相关网络[19]。

1.2.5 GO生物过程富集分析、KEGG代谢通路富集分析 利用Metascape分析平台对上述共同靶点进行GO(Gene Ontology)以及 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。将分析结果导入 R 语言，绘制GO富集分析二级分类柱状图，KEGG富集分析气泡图。

1.2.6 亚细胞分布 将“1.2.4” 项下筛选得到的核心蛋白，利用Genecards数据库检索获得亚细胞分布情况，选取 confidence=5 的分布位置并绘制网络图。

2 结果

2.1 调神攻坚汤有效成分及作用靶点 检索TCMSP数据库，以OB≥30%、DL≥0.18和Caco-2≥0.4作为检索条件，筛选出调神攻坚汤每味中草药的有效活性成分和可能作用靶点；对于方剂中石膏、牡蛎两味药材利用 BATMAN-TCMS 数据库进行活性成分分析以及靶点预测(见表1)。上述数据删除重复项后，获得调神攻坚汤有效活性成分166个，涉及相关作用靶点596个。

表1 调神攻坚汤化合物成分和靶点情况

2.2 肝纤维化相关靶点 将OMIM和Genecards数据库检索得到的肝纤维化治疗靶点合并后删除重复项，最终得到1 571个作用靶点。

2.3 筛选关键靶点和构建蛋白质相互作用网络 将调神攻坚汤可能作用靶点以及肝纤维化治疗靶点，利用 R 语言取交集后，得到方剂-疾病共同靶点(即调神攻坚汤抗肝纤维化作用靶点)193个(见图1)。将上述共同靶点导入STRING数据库构建PPI(见图2)。随后，通过Cytoscape软件中的Cytohubba插件通过MCC算法筛选出得分前20 的核心蛋白(包括ALB、INS、AKT1、TNF、IL-6等)并提取网络，并以度(degree)值大小反映节点大小与颜色深浅，以Combined score 反映连线的粗细(见图3)。

图1 Venn网络

图2 PPI网络

图3 核心蛋白网络

2.4 构建调神攻坚汤中药-成分-疾病靶点网络 将调神攻坚汤所含14味中药、166个有效活性成分及596个作用靶点导入Cytoscape 3.7.2软件构建“中药-有效活性成分-疾病靶点”可视化网络(见图4)。其中，紫色节点代表每味中药，蓝色节点代表有效活性成分，橙色节点代表可能作用靶点，连线代表彼此间的作用关系。

图4 调神攻坚汤中药-成分-疾病靶点网络

2.5 GO功能、KEGG通路富集分析 使用Metascape网络分析平台对之前获得的193 个调神攻坚汤抗肝纤维化作用靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。首先，筛选P值降序排列前20个的各类GO分析条目(包括细胞组分、生物过程、分子功能)并绘制二级分类柱状图(见图5)；图中纵坐标表示富集的数目，横坐标表示P值(见图5)。随后，筛选出 KEGG分析中P值最小的前20条通路绘制气泡图(见图6)；图中纵坐标表示KEGG通路的名称，横坐标表示富集基因所占的比例，气泡的大小表示富集的数目， 气泡的颜色表示富集的P值。以上结果表明，调神攻坚汤可能涉及脂质代谢、炎症反应、细胞凋亡和氧化应激等生物学过程，并且覆盖HIF-1、Foxo、PPAR等多条肝纤维化相关信号通路(见图7)。

图5 GO生物过程富集分析

图6 KEGG通路富集分析

图7 信号通路图

2.6 亚细胞分布情况 将193个调神攻坚汤抗肝纤维化作用靶点通过Genecards数据库进行检索并获取亚细胞分布情况，汇总后使用Cytoscape软件构建“亚细胞分布-靶点”可视化网络(见图8)。图中蓝色矩形节点亚细胞分布位置，黄色椭圆形节点代表调神攻坚汤抗肝纤维化作用靶点。结果表明，上述作用靶点主要分布于细胞外基质(extracellular,度值=11)、细胞核(nucleus，度值=11)、细胞膜(plasma membrane，度值=8)、细胞基质(cytosol，度值=7)、内质网(endoplasmic reticulum，度值=5)等亚细胞结构内。

图8 亚细胞分布

3 讨论

调神攻坚汤以柴胡为主药，配以黄芩、苏子、党参、夏枯草、王不留行、牡蛎、瓜蒌、石膏、陈皮、白芍、川椒、甘草、大枣共计14味中药。全方共奏疏肝、泄肝、柔肝、养肝、调肝、扶正抑木之效，最终达到疏肝理气，攻坚破瘀的功效。分析其配方组成及功效，我们初步猜测调神攻坚汤有抗肝纤维化的作用，因此，本研究通过网络药理学的方法探索此方剂治疗肝纤维化的潜在作用机制。通过数据库筛选出调神攻坚汤166个有效活性成分和596个可能作用靶点；与1 571个肝纤维化治疗靶点整合后，获得193个调神攻坚汤抗肝纤维化作用靶点。基于以上数据构建“中药-有效活性成分-疾病靶点”可视化网络，结果显示调神攻坚汤抗肝纤维化具有多成分、多靶点的特点，单靶点可被多种组分调控，单组分亦可作用于多个靶点，体现了中药方剂的复杂性和整体性。

随后，通过 STRING 数据库构建 PPI 后，筛选得到CTNNB1、 田TLR4、TNF、IL-6、STAT3等20个核心蛋白，即为调神攻坚汤抗肝纤维化的关键靶点。CTNNB1基因编码的β-连环蛋白(β-catenin)是黏附连接(adherens junctions,AJs)复合物的主要成分，并参与Wnt介导的细胞内信号传递，调控细胞的生长以及黏附过程。β-catenin信号的异常改变可激活肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)，而HSCs 则是肝纤维化发生发展过程中的细胞学基础；因此，β-catenin 是抗肝纤维化治疗的关键靶点。TLR4、TNF、STAT3、IL-6、CXCL8 是炎症相关的重要基因，而在肝纤维化进程中伴随着大量炎症介质的分泌以及炎症反应的发生。经典的 TNF 和IL-6-STAT3可以调控活化HSCs 的增殖、MMP2/9 的分泌以及ECM(如 I 型胶原、纤连蛋白)的生成。此外，TNF还可以抑制caspase-3活性,减少 HSCs 的凋亡，从而影响肝纤维化的转归。另有研究表明，与野生型小鼠相比，TLR4突变小鼠不易出现肝纤维化，但上述两组小鼠血清LPS(TLR4 的配体)水平却并无差异[20]。在酒精以及NASH诱导的肝纤维化中，TLR4主要通过Kupffer细胞分泌促炎细胞因子(如TNF、CCL2和CXCL8等)发挥作用[21-22]。

GO功能分析表明，调神攻坚汤可能通过影响细胞坏死和凋亡、脂质代谢、氧化应激反应、炎症反应等方面，抑制HSC的活化和增殖,进而达到干预肝纤维化的作用。KEGG通路分析表明，主要涉及HIF-1 signaling pathway、Foxo signaling pathway、Focal adhesion、PPAR signaling pathway等信号通路产生抗肝纤维化的作用。缺氧是肝纤维化发展过程中的常见特征，HIF-1是介导细胞参与缺氧反应的重要转录调控因子，可通过介导慢性炎症、细胞外基质沉积，上调一系列与肝纤维化相关基因的表达并激活HSC，加速肝纤维化发展。Foxo作为一种转录调控因子，与Wnt/β-catenin、EZH2、PI3K/Akt等信号通路相互作用，参与调控细胞的增殖与凋亡、物质代谢，还可促进心肌组织产生ROS，减少细胞遭受氧化应激的损伤[23-25]。Focal adhesion可将细胞与细胞外基质进行连接，引起细胞分化，迁移、扩散和凋亡，进而造成肝纤维化。PPAR可保持HSC静止，防止其活化或者增殖，是治疗纤维化的重要信号通路。此外，调神攻坚汤抗肝纤维化关键靶点主要分布于细胞外基质、细胞核、细胞膜、细胞基质、内质网等重要细胞结构上。亚细胞结构的研究为调神攻坚汤抗肝纤维化的药理学分子研究提供了有用指导。

综上所述，本研究采用网络药理学的方法对调神攻坚汤治疗肝纤维化的潜在作用机制进行了探析，并初步揭示了其抗肝纤维化的多成分、多靶点、多通路的复杂药理作用机制。结果显示此方剂可能通过HIF-1 signaling pathway、Foxo signaling pathway、Focal adhesion、PPAR signaling pathway等信号通路影响细胞凋亡、脂质代谢、氧化应激反应、炎症反应等方面，从而发挥治疗肝纤维化的作用，拓宽了调神攻坚汤在治疗肝纤维化方面的视角，为进一步开展调神攻坚汤抗肝纤维化相关研究提供了理论依据。