转运体生物标志物的研究进展

王嘉馨，林以宁

(中国药科大学中药学院，江苏 南京 211198)

药物转运体可以通过调节底物药物的吸收、分布、代谢、排泄过程来决定其在体循环和组织中的暴露程度[1]。随着对转运体研究的不断深入，其底物除药物外还包括各种内源性代谢物、微生物群和食物中含有的天然化合物。其中部分内源性物质作为转运体的底物，其浓度会随着转运体表达变化而变化[2]。因此，这些内源性物质将有潜力作为生物标志物来研究人体内转运蛋白的功能。

1 转运体的分布及功能

转运体作为一类功能性膜蛋白分布于体内各脏器组织，介导着内源性化合物与外源性物质的跨膜转运过程。根据其底物的跨膜转运方向可将转运体分为摄取型转运体(uptake transporters)和外排型转运体(efflux transporters)。其中摄取型转运体亦属于可溶性载体 (solute carrier,SLC)，主要包括有机阴离子 (organic anion transporters,OATs) 及阳离子转运体 (organic cation transporters,OCTs)、钠依赖性葡萄糖转运体 (sodium dependent glucose transporters,SGLTs)、氨基酸转运体 (L-type amino transporter,LAT)等。外排型转运体属于ATP结合转运体 (ATP binding cassette,ABC)，包括多药耐药相关转运体 (multidrug resistance associated proteins,MRPs)、 乳腺癌耐药转运体(breast cancer resistance protein,BCRP)、P 糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp)等。

1.1 有机阴离子转运多肽(OATPs) SLC21/SLCO家族成员，有机阴离子转运多肽1B1(organic anion-transporting polypeptide 1B1，OATP1B1)、有机阴离子转运多肽1B3(organic anion-transporting polypeptide 1B3，OATP1B3)主要在人体肝脏中表达，介导内源性物质和外源性物质通过肝细胞基底外侧膜从门静脉血液进入肝细胞。OATP1B1和OATP1B3底物有部分重合，但对各自底物的亲和力有所不同。通过OATP1B1和OATP1B3转运的内源性物质主要有胆汁酸、粪卟啉和胆红素等。OATP1B1和OATP1B3底物药物包括他汀类如瑞舒伐他汀，抗癌药物如甲氨蝶呤，以及利福平等抗生素[3]。

1.2 有机阴离子转运体(OATs) 有机阴离子转运体中的OAT1和OAT3主要在人体肾脏中表达，定位于近端小管细胞基底膜。内源性物质如α-酮戊二酸酯和前列腺素E2等属于OAT1和OAT3的底物[4]。部分药物阿昔洛韦、甲氨蝶呤、环丙沙星等属于OAT1的底物，OAT3底物药物主要为呋塞米、布美它尼及几种非甾体消炎药等。丙磺舒与新生霉素是OAT1与OAT3的主要体外抑制剂[5]。

1.3 有机阴阳离子转运体(OCTs) 有机阳离子转运体2(OCT2)与OAT属同一家族，主要表达于人体肾脏，定位于近端小管细胞基底外侧膜。OCT2以非钠依赖的方式转运带正电荷的化合物，在肾脏分泌有机阳离子的过程中发挥重要作用，其体外底物有1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(MPP+)、四乙基铵(TEA)等。其内源性底物包括乙酰胆碱、肌酐、N1-甲基烟酰胺和肾上腺素等。

1.4 多药及毒性化合物外排转运蛋白(MATEs) 多药及毒性化合物外排转运蛋白1(multidrug and toxin extrusion proteins 1,MATE1)和MATE2-K属于溶质载体家族SLC47。MATE1在肾脏、肝脏、肾上腺以及其他组织中表达，而MATE2-K主要在肾脏中表达。MATE1和MATE2-K都位于肾近端小管的刷状边缘膜，介导有机阳离子向细胞外转运[6]。MATEs与OCT2的底物有部分重叠，在肾小管分泌中共同发挥作用。MATEs的内源性底物有N1-甲基烟酰胺、肌酐和硫胺素等，二甲双胍、普鲁卡因等属于其外源性药物底物。

2 生物标志物的要素

一系列药物转运体以结构多样的临床药物为底物，通过促进这些药物从血液循环中被摄取或随后外排到另一侧来调节药物的药代动力学。此外，药物转运体的功能可以被更广泛的抑制剂抑制。因此，在药物开发过程中，识别每个药物转运体的底物和抑制剂对于研究药物相互作用(drug-drug interaction,DDI)中底物药物的临床药代动力学特性有重要意义[7]。由此，多种转运体底物药物组成的“鸡尾酒”探针常被用来研究DDI，以期减少分析底物药物所需临床研究的数量。然而，在临床数据有限的情况下，通过分析内源性生物标志物来探究DDI不失为一种可行的替代方法[8]。评估一种内源性化合物能否作为研究转运体功能的生物标志物，需要从多个方面进行验证[8]。

2.1 灵敏度 生物标志物的浓度变化程度应能区分弱、中、强的抑制剂，并能预测临床相关药物引起的DDI。此外，生物标志物应能在合适的基质(血浆、血清、尿液、唾液等)中被检测到，且具有稳定的基线、较小的个体间变异性[2]。

2.2 选择性 由于许多药物转运体的底物相互重叠，寻找对某一转运体具有高度特异性的生物标志物并不现实，因此，半选择性生物标志物的研究可行性更高。另外，将生物标志物的体内测定数据与单一转运体的体外数据相结合，能更好地综合评估其选择性并建立体内外相关性。

2.3 稳定性 在理想情况下，生物标志物的水平不应受到疾病状态、日变化、年龄、饮食或锻炼等因素的影响。此外，应考虑生物标志物的生成和降解速率，以便在临床环境中进行监测[9]。还应探索评估生物标志物形成和消除速率的建模方法，用于判断生物标志物是否适合于临床应用，并指导生物标志物样本采集的时间和频率。

2.4 其他要素 理想的生物标志物应具有明确的最佳动力学参数，例如血浆浓度、药-时曲线下面积(area under concentration-time curve，AUC)或肾脏清除率(renal clearance，CLr)等。此外，还应具备可预测性，即转运体抑制剂引起的内源性生物标志物的变化最好能够与DDI中转运体抑制剂引起其他合用药物药动学的变化建立定量关系。

3 肝肾转运体潜在生物标志物

生物标志物作为一种评价生理过程、病理过程和药物干预反应的指示物，常被用于评估DDI中转运体的抑制作用。一些内源性化合物已被鉴定为部分肝肾转运体的潜在生物标志物，在评估转运体功能方面具有重要作用。

3.1 OATPs的生物标志物

3.1.1 粪卟啉Ⅰ和Ⅲ(coproporphyrins Ⅰ and Ⅲ) 粪卟啉Ⅰ和Ⅲ都是OATP1B1和 OATP1B3的底物[10]。粪卟啉Ⅰ是血红蛋白生物合成过程中的代谢产物，由于其日变化及个体间变异性微小，且在给予OATP1B抑制剂后浓度变化迅速而显著，是OATP1B生物标志物的不二之选[11]。有研究表明，在给予OATP抑制剂利福平后，粪卟啉Ⅰ和Ⅲ的最大血药浓度(Cmax)增加5倍， AUC增加3倍，且尿中粪卟啉Ⅰ含量增加约3.5倍，说明血浆粪卟啉Ⅰ和Ⅲ以及尿粪卟啉Ⅰ都是研究OATP参与DDI的较为合适的生物标志物[12]。

粪卟啉Ⅰ和Ⅲ是一对同分异构体，但粪卟啉Ⅰ比粪卟啉Ⅲ更适合做OATP1B的生物标志物，原因如下：①粪卟啉Ⅲ还能被OATP2B1转运，而粪卟啉Ⅰ不能；②粪卟啉Ⅲ的血药浓度比粪卟啉Ⅰ低5.7倍，需要高灵敏度的分析系统进行定量；③人类粪卟啉Ⅲ的肾清除率是粪卟啉Ⅰ的6.2倍[12]；④利福平诱导粪卟啉Ⅲ的AUC变化小于粪卟啉Ⅰ,表明OATP1B对粪卟啉Ⅲ系统性消除效果较弱。

3.1.2 胆红素 OATP1B1和OATP1B3能够转运胆红素和结合胆红素，并且在其处置过程中发挥重要作用[13]。除OATPs外，结合胆红素还通过定位于肝细胞小管膜的共轭外排泵多药耐药蛋白2(multidrug resistance associated protein 2,MRP2)以及定位于肝细胞窦膜的MRP3进行转运[13]。有体外研究和大鼠实验表明，结合胆红素可作为临床早期药物开发中探究OATP/MRP2抑制的生物标志物[14]。有研究发现，OATP抑制剂利福平可使总胆红素的AUC和Cmax分别增加2.1和2.3倍[15]。有学者认为胆红素血浆浓度的变化相对较小，在评估较弱的OATP抑制剂时尤为明显，说明胆红素作为内源性生物标志物的灵敏度有限[15]。此外，多种酶和转运体都参与了胆红素的处置，如果将胆红素用于研究OATP参与的DDI，应全面评估药物的特异性[15]。

3.1.3 甘氨鹅脱氧胆酸硫酸盐(glycochenodeoxycholate sulfate，GCDCA-S) GCDCA-S能被OATP1B1和OATP1B3转运[16]，是胆汁酸的主要硫酸化产物，在血清和尿液中约占总胆汁酸硫酸化产物的四分之一。胆汁酸的合成是多种酶参与的多步骤过程，而磺基转移酶2A1催化的胆汁酸硫酸化是胆汁酸进一步代谢的主要途径。胆汁酸硫酸化后，胆汁酸盐的溶解度提高、肠肝循环减弱、排泄增加，可促进胆汁酸解毒和排泄。在健康志愿者中，GCDCA-S的血浆浓度呈现昼夜变化趋势[17]。一般情况下，进食后血清胆汁酸浓度升高，而尿液胆汁酸浓度略有下降[18]。性别、年龄、体重指数和适度饮酒对血清和尿液的胆汁酸浓度影响很小[18]。鸡尾酒试验表明，与配方中3种探针药物相比，利福平对GCDCA-S的AUC影响更明显，由此，GCDCA-S有可能作为内源性生物标志物来研究体内OATP的活性[16]。

3.1.4 胆汁酸和胆汁酸结合物 有学者研究了OATP1B1和OATP1B3介导的5种人体主要胆汁酸及其甘氨酸和牛磺酸结合物的转运，包括胆酸(CA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、去氧胆酸(DCA)、熊去氧胆酸(UDCA)和石胆酸(LCA)。结果表明CA、CDCA、DCA以及甘氨酸和牛磺酸结合胆汁酸能被OATP1B1和OATP1B3转运，且与胆汁酸相比，胆汁酸结合物与OATP1B1和OATP1B3的亲和力更强[19]。胆汁酸自身的肠肝循环是影响其血浆浓度的重要因素，除体循环的清除机制外，在肠肝循环过程中可能存在与药物相互作用的位点，导致其血浆浓度-时间分布的改变[7]。

有研究者考察了13种胆汁酸作为OATP活性的内源性生物标志物的适用性，发现其中8种胆汁酸的血浆浓度在第一次进食后显著增加。给予OATP抑制剂利福平后部分胆汁酸如甘氨脱氧胆酸等的血浆浓度均显著升高，但重复模型显示其血浆浓度的增加并不显著[20]。具体哪些胆汁酸或胆汁酸结合物适合作为OATP1B的内源性生物标志物，还有待进一步的研究。

3.2 OATs的生物标志物

3.2.1 6β-羟基氢化可的松(6β-hydroxycortisol，6β-OHF) 6β-OHF是评价OAT3活性的一种重要内源性生物标志物，由肝脏CYP3A4酶代谢生成并经尿液排泄，其血浆浓度具有明显的昼夜节律[21]。体外研究表明，6β-OHF是OAT3、MATE1和MATE2-K的底物[22]。有学者评估了OAT抑制剂丙磺舒和MATE抑制剂乙胺嘧啶对6β-OHF肾脏清除率的影响，结果表明与对照组相比，丙磺舒给药组6β-OHF的AUC显著升高，且6β-OHF的CLr显著降低。虽然给予乙胺嘧啶后6β-OHF的AUC有所增高，CLr也有所降低，但变化并没有统计学意义，说明6β-OHF对MATE的特异性低于OAT[21]。体内和体外数据均证实了OAT3在6β-OHF的肾脏分泌过程中发挥重要作用，说明6β-OHF可能是评估OAT3功能的潜在内源性生物标志物。

3.2.2 牛磺酸与甘氨鹅脱氧胆酸硫酸盐(GCDCA-S) 牛磺酸和GCDCA-S分别为OAT1和OAT3的内源性底物。牛磺酸是一种可从食物中获得也可通过人体自身合成的氨基酸。有学者研究了丙磺舒对血浆和尿液样本中内源性化合物浓度变化的影响，认为牛磺酸和GCDCA-S可作为评估OAT功能的内源性生物标志物[17]。与6β-OHF相比，丙磺舒对牛磺酸和GCDCA-S的AUC无影响，但在口服丙磺舒后，牛磺酸和GCDCA-S的CLr均显著降低[17]。此外，有研究表明丙磺舒可通过抑制参与GCDCA-S重吸收的OAT4和参与GCDCA-S尿排泄的MRP2影响GCDCA-S的CLr，由此，GCDCA-S是否适合作为OAT内源性生物标志物还需要进一步综合评估[23]。总体数据表明，牛磺酸和GCDCA-S可作为评估OAT1和OAT3功能的潜在生物标志物。

3.3 OCT、MATE的生物标志物

3.3.1 硫胺素 硫胺素也被称为维生素B1，被硫胺素焦磷酸激酶转化为硫胺素焦磷酸，可作为辅酶参与细胞代谢的关键反应。有研究者通过代谢组学分析，证明了硫胺素是人类OCT1的底物。然而，硫胺素对OCT1的选择性很低，因为它也是OCT2、MATE1、MATE2-K以及硫胺素转运体1和2(THTR1和THTR2)的底物[24]。THTR1和THTR2在各种组织中广泛表达且在硫胺素的重吸收和排泄过程中发挥重要作用，因此，想要通过硫胺素血浆浓度变化来指示OCT1功能，需要进行更加全面的分析[25]。

有研究证明硫胺素可用于监测MATE的抑制作用[24]。该研究分析了乙胺嘧啶对二甲双胍药代动力学的影响，并对血浆和尿液样本中的硫胺素进行分析，结果表明硫胺素的血浆浓度几乎未受到影响，但其CLr降低了70%～84%。而在给予乙胺嘧啶后，低剂量和治疗剂量的二甲双胍CLr仅分别降低了23%和34%[24]。这一结果说明，与二甲双胍相比，硫胺素通过CLr评估乙胺嘧啶引起的MATE抑制时可能具有更高的灵敏度。硫胺素有作为OCT和MATE内源性生物标志物的潜力，但其他OCT/MATE抑制剂对硫胺素的血浆浓度及CLr的影响还有待进一步研究[26]。

3.3.2 N-甲基烟酰胺 N-甲基烟酰胺是色氨酸和烟酸的代谢产物。N-甲基烟酰胺是OCT2、MATE1和MATE2-K的底物，体外研究证实乙胺嘧啶能够抑制这些转运体对N-甲基烟酰胺的摄取。在健康受试者中，N-甲基烟酰胺的血浆浓度遵循昼夜节律。有报道称，低温引起的物理应激会增加尿中N-甲基烟酰胺的排泄；在妊娠中后期，N-甲基烟酰胺的CLr有所增加[27]；某些疾病也可以影响N-甲基烟酰胺的药代动力学。有研究表明，给予MATE抑制剂乙胺嘧啶后，N-甲基烟酰胺的尿排泄量和CLr都有所降低[28]。N-甲基烟酰胺是用于研究OCT/MATE参与的DDIs的潜在生物标志物，与此同时，N-甲基烟酰胺的CLr变化的灵敏度、N-甲基烟酰胺对其他MATE1及MATE2-K抑制剂的特异性等还需要进一步研究[29]。

4 生物标志物评估转运体功能的意义及局限性

目前，使用体外数据来评估药物转运体DDI仍存在一些局限性。例如，一些转运体含有多种药物结合位点，导致其抑制作用呈底物依赖性，从而使得体外模型的研究数据在推测临床DDI时更加困难。且候选药物在体外的低溶解度以及非特异性结合现象往往使数据分析过程复杂化。因此，仅靠体外研究数据推测临床药物转运体的DDI是不现实的，需要对作为研究转运体DDI潜在指标的内源性生物标志物进行分析，以补充和完善药物转运体的体外数据[8]。

大多数生物标志物的灵敏度低于药物特异性探针，其背后的原因值得进一步探究。内源性生物标志物与药物探针的主要区别之一，是内源性生物标志物是体内形成的化合物，而药物探针的暴露受其吸收和分布的影响。除非生物标志物在稳态条件下其血浆浓度较为稳定，否则DDI对其体内暴露的影响除了取决于转运体介导的消除速率外，还取决于其生成速率。因此，直接比较二者AUC变化可能会低估内源性生物标志物的灵敏度[8]。此外，在解释生物标志物水平为何变化时，应从多个方面考虑其原因。例如，血浆中胆红素或结合胆红素的浓度升高，可能是由于OATP1B、MRP2的抑制，也可能是肝损伤所致[13]。

将内源性生物标志物用于指示转运体功能的主要困难之一，是对其形成、处置和消除机制的了解还不够全面。再者，生物标志物的选择性、特异性、灵敏度以及受试者间的可变性等需要进行综合评估[30]。一些潜在的生物标志物，如胆汁酸或胆红素，其水平变化与器官损伤或疾病发展有关，导致其评估转运体DDI更加困难。此外，部分生物标志物的来源还包括膳食成分或代谢物，在进行分析时应注意排除食物的影响。

5 展望

近年来，用内源性化合物评估转运体介导的DDI受到了越来越多的关注，这些研究成果将有助于药物开发和临床阶段转运体变化的机制研究，从而达到提高药物开发及治疗安全性的目的。然而，目前对于影响生物标志物体内处置因素的探究以及用于评估生物标志物的模型研究还有待完善。还有许多转运体的内源性功能并不明确，例如P-糖蛋白(P-gp)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)，关于其内源性底物的研究十分有限，其内源性生物标物的验证也许是今后研究的一个方向。