抗衰老口服液对产后小鼠子宫复旧的效果及机制研究

冯睿，叶冠

(上海医药集团股份有限公司中央研究院，上海 201203)

女性在妊娠和分娩前后，子宫将发生巨大的变化。分娩后，子宫将开始重塑，逐渐恢复正常的生理周期以及未孕时的大小，该过程则称为子宫复旧。现代医学认为，通过止血、补血、增强子宫收缩力等途径可以有效促进子宫复旧[1]，但大多数治疗手段只集中于某一方面。近年来，中药因其多成分、多靶点、多通路、不良反应少等特点被广泛地应用于各种现代疾病的治疗中。抗衰老口服液为一种中药复方制剂，源于明代益寿永真膏，由红参、生地黄、天冬、麦冬、地骨皮、茯苓等单味药组合而成，具有益气养阴、补血安神的作用。作为一款应用广泛的非处方药品，抗衰老口服液常用于产后虚弱，更年期综合征，中、老年体弱者因气阴两虚所致的神疲乏力、烦躁失眠、心悸气短等症。上市销售四十年来的临床应用发现，抗衰老口服液具有改善产妇产后虚弱，促进子宫恢复，预防产后并发症发生的功效。本研究通过观察产后小鼠体能变化，出凝血情况，补血情况，离体子宫功能，子宫内膜和子宫肌层组织中相关蛋白表达的变化，从自噬和凋亡的角度考察抗衰老口服液对子宫复旧过程的影响并探讨其可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物 健康未孕雌性ICR小鼠10只，清洁级，体重18～23 g，分娩后第1天的产后ICR小鼠100只，清洁级，体重37～45 g，购于常州卡文斯实验动物有限公司，生产许可证：SCXK(苏)2016-0010，使用许可证：SYXK(苏)2017-0040。饲养于实验动物独立通风系统，室温(23±2)℃，湿度50%±5%，正常昼夜交替，自由饮食。动物实验遵循动物伦理委员会规定，伦理审查编号为OGKQSPF/SQ-11。

1.2 药物 抗衰老口服液(正大青春宝药业有限公司，批号：1909002)，规格：10 mL/支，人用量20 mL·d-1。缩宫素注射液(安徽宏业药业有限公司，批号：181203)，规格：5 U·mL-1。

1.3 主要仪器 紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司，型号：UV-5100)；光学显微镜(南京江南永新光学有限公司，型号：XD-202)。MD3000-C生物信号采集处理系统、离体组织灌流系统、张力换能器、多道生理记录仪、相关数据分析软件(安徽正华生物仪器设备有限公司)；垂直电泳装置(北京市六一仪器厂，型号：DYCZ-24DN)。

1.4 试剂及耗材 苯甲酸雌二醇(上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10042617)；蔗糖、NaCl、KCl、MgSO4、NaH2PO4·2H2O、葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司，批号分别为20190326、20190926、20180110、20200220、F20100519、F20100722)；NaHCO3(上海久亿化学试剂有限公司，批号：20100901)；CaCl2(南京化学试剂有限公司，批号：10041420263)；苯甲酸钠(食品级，江苏凯瑞生物科技有限公司)；Hb检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20200713)；Bax、caspase-3(cleaved)、MCL1、mTOR、Phospho-mTOR、Phospho-p53、p53、LC3-I、LC3-II、GAPDH一抗、山羊抗兔IgG(南京恩晶生物科技有限公司，货号分别为E2511550、E11-0104L、E2612226、E2510675、E2530094、E8ET1606-24、E11-10276C、E2613707、E2620270、E20-53445、E0L3012-2)。

2 实验方法

2.1 试剂制备 台氏液采用去离子水配制，1 000 mL台氏液含NaCl 8.0 g、10% KCl 2.0 mL(0.2 g)、10% MgSO4·7H2O 2.6 mL(0.26 g)、5% NaH2PO4·2H2O 1.3 mL(0.065 g)、NaHCO31.0 g、1 mol·L-1CaCl21.8 mL(0.2 g)、葡萄糖 1.0 g。

2.2 分组与给药 体内实验：将50只产后小鼠随机分为生理盐水对照组(等量生理盐水)，辅料对照组(蔗糖390 mg·kg-1；苯甲酸钠3.25 mg·kg-1)，低剂量组(抗衰老口服液1.3 mL·kg-1，相当于1/2临床等效剂量)，中剂量组(抗衰老口服液2.6 mL·kg-1，相当于临床等效剂量)，高剂量组(抗衰老口服液5.2 mL·kg-1，相当于临床等效剂量的2倍)，每组10只，连续灌胃给药14 d。离体子宫实验：将小鼠分为6组，每组10只，其中正常对照组为健康未孕雌性小鼠，其余5组为产后小鼠。脱颈椎处死后剖取子宫，正常对照组和产后空白组仅给予台式液，产后低、中、高剂量组分别给予0.125、0.25、0.5 mL口服液/mL台氏液，催产素组给予0.013 U缩宫素/mL台氏液。

2.3 体重检测 用电子天平称量生理盐水对照组、辅料对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠给药前及实验结束后的体重，记录数据。

2.4 游泳时间检测 末次给药1 h后，在生理盐水对照组、辅料对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠尾根部1 cm处负荷小鼠10%体重的铅丝，置于水箱中游泳，箱内水深40 cm，水温(20±3)℃。记录小鼠从游泳开始至头部沉入水中8 s不能浮出水面且翻正反射消失的时间为游泳时间，计算各组小鼠与对照组相比的时间延长率。

2.5 出血时间检测 末次给药1 h后，用手术剪将生理盐水对照组、辅料对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠尾尖5 mm处剪断，待血液自行流出，开始以秒表计时，每30 s用滤纸吸去血滴1次，直到血液停止流出为止，记录出血时间。

2.6 凝血时间检测 末次给药1 h后，用内径约为1 mm的熔点毛细管测定生理盐水对照组、辅料对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠从毛细管内眦采血到管内出现血凝丝的凝血时间。

2.7 补血作用检测 连续灌胃给药7 d或14 d，通过眼眶静脉采血，用试剂盒检测生理盐水对照组、辅料对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠灌胃给药前、给药7 d和给药14 d各组的血红蛋白量、红细胞数。

2.8 离体子宫功能检测 实验前1天，正常对照组小鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇(0.1 mg·kg-1)以造成动情期，实验当天同产后空白组、产后低剂量组、产后中剂量组、产后高剂量组以及催产素组小鼠一同脱颈椎处死，剖取子宫置于盛有台氏液的玻璃皿内，取离体子宫中间段约3～4 cm，一端固定于盛有15 mL台氏液的浴槽通气钩，一端连接张力换能器，浴槽中温度维持在(37.0±0.5)℃，同时通气，给予一定的前负荷力。在浴槽中加入不同剂量的抗衰老口服液及缩宫素，采用MD3000-C生物信号采集处理系统采集相关数据，采样频率4 kHz，扫描速度5.0 s/div，连续描计5 min正常收缩曲线，计算5 min内收缩张力最大值、平均值以及收缩频率。

2.9 Western blot法检测离体子宫组织凋亡、自噬信号通路相关蛋白 取小鼠离体子宫组织用组织匀浆器于冰上充分研磨，用低温离心机离心后取上清，得到小鼠子宫组织蛋白样品，并用BCA法进行蛋白定量。通过SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后孵育相应一抗和二抗，而后用ECL试剂盒显影，采用Image J分析蛋白条带灰度值。

3 实验结果

3.1 对产后小鼠的抗疲劳作用 与生理盐水对照组比，服用抗衰老口服液明显延长产后小鼠的游泳时间。中、高剂量组差异具有统计学意义(P<0.01)，游泳时间延长率呈剂量依赖性增长(见表1)。

表1 抗衰老口服液对产后小鼠游泳时间的影响

3.2 对产后小鼠出、凝血时间的影响 抗衰老口服液各剂量组产后小鼠出血时间和凝血时间较生理盐水对照组明显缩短(P<0.05)，并且高剂量组的出血时间差异有统计学意义(P<0.01)(见表2)。

表2 抗衰老口服液对产后小鼠出、凝血时间的影响

3.3 对产后小鼠的补血作用

3.3.1 给药7 d对产后小鼠血红蛋白Hb及红细胞数RBC的影响 连续给药7 d后，与生理盐水对照组相比，抗衰老口服液各剂量组小鼠Hb显著升高，且高剂量组差异有统计学意义(P<0.01)。此外，抗衰老口服液各剂量组RBC显著升高，且低剂量组差异有统计学意义(P<0.01)(见表3)。

表3 抗衰老口服液给药7 d对产后小鼠Hb、RBC的影响

3.3.2 给药14 d对产后小鼠血红蛋白Hb及红细胞数RBC的影响 给药14 d后，与生理盐水对照组相比，产后小鼠Hb、RBC未见明显统计学差异(P> 0.05)(见表4)。

表4 抗衰老口服液给药14天对产后小鼠Hb、RBC的影响

3.4 对小鼠离体子宫功能的影响

3.4.1 对小鼠离体子宫收缩张力的影响 与正常对照组即未孕小鼠相比，产后小鼠子宫收缩张力最大值、平均值均增大(P<0.01)。与产后空白组相比，给予相应药物后，小鼠离体子宫收缩张力最大值和平均值均有所增大，其中产后中、高剂量组、催产素组的平均张力差异有统计学意义(P<0.01)(见表5)。

表5 抗衰老口服液对小鼠离体子宫收缩张力最大值和平均值的影响

3.4.2 对小鼠离体子宫收缩频率的影响 产后小鼠离体子宫收缩频率较正常对照组显著上升(P<0.01)。与产后空白组相比，给药后的产后高剂量组、催产素组离体子宫收缩频率差异有统计学意义(P<0.01)(见表6)。

表6 抗衰老口服液对小鼠离体子宫收缩频率的影响

3.4.3 对小鼠离体子宫活动力的影响 产后小鼠离体子宫活动力较正常对照组显著上升(P<0.01)。与产后空白组相比，产后高剂量组和催产素组小鼠离体子宫活动力均明显提高(P<0.01)(见表7)。

表7 抗衰老口服液对小鼠离体子宫活动力的影响

3.4.4 对小鼠离体子宫内膜组织凋亡信号通路相关蛋白表达水平的影响 与正常对照组相比，产后小鼠子宫内膜促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的蛋白表达显著增加(P<0.01)。与产后空白组相比，抗衰老口服液中、高剂量显著降低Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平(P<0.05)，催产素组Bax和cleaved caspase-3水平差异有统计学意义(P<0.01)，而抗凋亡蛋白MCL1的蛋白表达无明显差异(P> 0.05)(见表8、图1)。

表8 小鼠离体子宫内膜组织的凋亡信号通路相关蛋白表达

A.正常对照组；B.产后空白组；C.产后低剂量组；D.产后中剂量组；E.产后高剂量组；F.催产素组图1 各组子宫内膜组织凋亡信号通路相关蛋白表达比较

3.5 对小鼠离体子宫肌层组织自噬信号通路相关蛋白表达水平的影响 与正常对照组相比，小鼠子宫肌层MCL1、p-mTOR的蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，而p-P53、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ水平明显升高(P<0.01)。产后中、高剂量组和催产素组MCL1、p-mTOR水平较产后空白组显著升高(P<0.05,P<0.01)，尤以产后高剂量组和催产素组更为明显，而p-P53、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的蛋白表达则呈剂量依赖性显著降低(P<0.05,P<0.01)(见表9、图2)。

表9 小鼠离体子宫肌层组织的自噬信号通路相关蛋白表达

A.正常对照组；B.产后空白组；C.产后低剂量组；D.产后中剂量组；E.产后高剂量组；F.催产素组图2 各组子宫肌层组织自噬信号通路相关蛋白表达比较

4 讨论

正常情况下，女性分娩后需要6～8周时间使子宫恢复到孕前状态[2]，该过程中易出现宫缩乏力、恶露不尽、产后腹痛的现象，若不及时治疗则可能引起月经失调、子宫内膜炎、继发性贫血甚至失血性休克等并发症，对产妇的身心健康产生严重影响[3]，因此促进子宫复旧以避免产后并发症的发生具有重要意义。目前，临床上常采用催产素等药物加强子宫收缩，减少出血风险以促进产后恢复[4]。催产素虽然具有价格低廉，起效快等优点，但也存在着维持时间短，需持续注射等弊端[5]。如今，研究者对于中医药促进产后复旧的关注度越来越高，相关的临床和实验研究均证实了中药具有良好的临床疗效[6]，这表明中医药或能在促进产后复旧方面发挥其卓越的作用。

本研究中，给予抗衰老口服液后，产后小鼠游泳时间明显提升，提示可能与抗衰老口服液提高机体活力、促进产后机体恢复有关。目前，我国孕产死亡的因素中，产后出血仍处于第1位[7]，抗衰老口服液显著降低产后小鼠的出血、凝血时间，说明其具有一定的止血作用。此外，给予抗衰老口服液7 d使产后小鼠Hb、RBC增加，说明抗衰老口服液具有促进机体生血、补血的作用，然而给予14 d后，Hb、RBC的增加并不显著，这可能与产后小鼠经过一定时间后机体的自愈能力有关。产后出血发生的主要原因之一为宫缩乏力。现代药理研究发现，抗衰老口服液中的皂苷类成分可加强子宫平滑肌收缩，增加对肌间血管的压力从而有效止血[8-9]。实验结果显示，抗衰老口服液能提高产后小鼠子宫的收缩张力、收缩频率及子宫活动力，其中以高剂量组最为显著，这说明抗衰老口服液对产后小鼠子宫的功能恢复具有一定的促进作用。

现代研究认为，子宫内膜与子宫肌层重塑使得子宫恢复到妊娠前的大小[10]，这与细胞凋亡和自噬密切相关[11-12]。妊娠期间，由于MCL1介导的抗凋亡信号增强，子宫caspase-3保持非凋亡状态。足月到分娩期间，子宫中MCL1介导的抗凋亡信号减弱，激活子宫内膜凋亡信号。本研究发现，产后离体子宫内膜组织中抗凋亡蛋白MCL1无明显变化，而Bax、cleaved caspase-3介导的凋亡信号表达水平升高，正说明了保护性的抗凋亡信号中断，子宫内膜凋亡信号激活。给予抗衰老口服液后，凋亡信号表达明显降低。说明抗衰老口服液抑制子宫内膜细胞过度凋亡，进一步促进内膜修复。有研究表明，子宫收缩及缩复导致肌层血流量减少，从而使子宫肌细胞处于饥饿状态[13]。因此，自噬被激活，通过降解非必要的细胞成分，释放营养物质，而MCL1调节着凋亡与自噬的平衡[14]。本研究发现，产后小鼠离体子宫肌层组织中MCL1和抑制自噬过程的p-mTOR水平显著降低，而抑制mTOR信号转导的p-P53则显著增加，使得子宫肌层自噬作用进一步增强，这一点也通过自噬标记物LC3-Ⅱ[15]的表达增加得到了证实。有研究发现，LC3-Ⅱ在产后第1天小鼠的子宫肌层组织中表现出显著地增加[16]。类似的，本研究发现产后小鼠离体子宫肌层中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的蛋白表达水平显著升高，给予抗衰老口服液和催产素均能使其显著下调。这些数据表明，抗衰老口服液对于调节子宫内膜凋亡信号通路和子宫肌层自噬信号通路具有一定调节作用，或能促进产后子宫组织快速重塑。综上所述，抗衰老口服液对产后子宫复旧具有积极的促进效果，可能与其调控凋亡和自噬相关蛋白有关。