MicroRNA与乳腺癌关系的研究进展

简正伟综述，万腊根审校

(南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330006)

微小RNA(miRNAs,miR)为一类长度约21～22核苷酸(nucleotide,nt)的单链非编码小RNA分子。1993年Lee等[1]首次在线虫体内发现第一个miRNA(lin-4)，能在翻译水平通过抑制核蛋白lin-14的表达来调节线虫的幼虫发育进程。一系列的研究表明，miRNA在机体正常发育、分化、生长及凋亡中发挥重要的作用，如胚胎发育、细胞生长和凋亡、血细胞分化、神经元的极性、胰岛素分泌、大脑形态形成、心脏发生和脂肪代谢等，随着研究的进展，对miRNA的研究从量的表象变化已经慢慢过渡到作用机制，从此揭开了科研工作者对此类体内广泛存在的基因调控方式研究的序幕[2]。据报道人类细胞中已经发现的miRNA已达几百余种，通过全世界科学家的不懈努力，已经成功构建了miRNA数据库。据科学家推测人类基因组中大约存在着1000余种miRNA，虽然它仅占总编码RNA基因数量的1%，但它却能调控着人类基因组约占30%的蛋白质编码基因的表达,在基因调节中具有不可替代的作用[3]。

1 miRNA的生物学作用

miRNA由基因组DNA编码，通过RNA聚合酶Ⅱ协助转录产生初始的miRNA—Pri-miRNA，Pri-miRNA在核内被RNA酶III家族成员Drosha加工成一个70nt左右具发夹结构的单链RNA前体(Pre-miRNA)，即miRNA的前体。Pre-miRNA再与双链RNA结合蛋白DGCR8结合。然后在小分子单体G蛋白依赖的转运受体exportin-5作用下，转运至细胞浆中。在RNA酶III家族酶Dicer的切割作用下产生约22nt左右的成熟miRNA。随后成熟的miRNA双链解旋，其中的一条成熟单链结合到RNA诱导沉默复合物中，通过与靶mRNA特异性碱基配对的方式，与目标mRNA的3'-UTR区互补配对，引起翻译的抑制或mRNA的降解[4]。当它与mRNA完全互补配对时，miRNA的作用方式和RNA干扰相似，即与完全互补的同源mRNA配对结合，导致mRNA切割或降解；当它与mRNA不完全互补配对时，则会阻遏转录后翻译[5]。其结果导致相应蛋白质合成的减少或缺失，从而导致疾病的发生。

2 miRNA在肿瘤中的作用

随着人们对miRNA认识和了解,越来越多的研究发现它与肿瘤的形成有着密切的关系，大部分的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点(fragile-site)上，miRNA通过调控靶基因参与的信号通路，影响肿瘤发生发展,发挥类似癌基因或抑癌基因的功能。说明miRNAs在肿瘤发生发展过程中起着至关重要的作用。有些miRNA在肿瘤中过表达可以被看作“致癌基因”，它们通过负性调节抑癌基因或控制细胞分化和凋亡基因的作用，从而促进肿瘤的发生发展，如miR-21[6]。有些在肿瘤中表达减低miRNA可以被看作 “抑癌基因”，抑癌miRNA通过调节抑癌基因或控制细胞分化和凋亡基因的作用，从而抑制或者延缓肿瘤的发生发展，如miRNA-145[7]。越来越多的研究表明，miRNA参与了包括结肠直肠癌、垂体腺瘤、肺癌、宫颈癌、肝癌、甲状腺癌、胰腺癌、神经母细胞瘤、白血病以及乳腺癌等在内的多种肿瘤的发生、发展过程。

乳腺癌是目前女性最常见的恶性肿瘤之一，据资料统计，发病率约占全身各种恶性肿瘤的7%-10%，在妇女中仅次于子宫癌的一种全身性的恶性疾病。乳腺癌在美国每年新增病例约18万例，死亡约4万余例，是仅次于肺癌的一种恶性疾病。在我国乳腺癌的发病也呈逐年上升趋势。目前研究发现，有多种miRNA在乳腺癌中有不同形式的表达。

3 在乳腺癌中起到致癌基因作用的miRNA

在乳腺癌中起到致癌基因作用的miRNA见表1,其中作用机制研究比较清楚的有miR-21、miR-155、miR-10b。

表1 乳腺癌中起到致癌基因作用的miRNA

3.1 miR-21

miR-21已经被发现在多种实体瘤中高度表达，包括乳腺癌[8]。Si ML等用RT-PCR的方法分析157种人类miRNA，比较正常乳腺组织和乳腺癌组织，结果发现miR-21在乳腺癌病人中高度表达。为了更好的验证这一结果，作者用抗miR-21寡核苷酸转染乳腺癌MCF-7细胞，结果发现抗miR-21寡核苷酸在体外抑制细胞生长，在异种移植的小鼠中抑制肿瘤生长。同时抗miR-21寡核苷酸能够增加凋亡和减少细胞增殖[9]。

研究表明miR-21的作用靶点主要包括以下几点：(1)PTEN(phosphatase and tensin homolog),它是迄今发现的第一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因，也是继p53基因后另一个较为广泛地与肿瘤发生关系密切的基因。PTEN通过去磷酸化作用参与细胞调控，从而调节细胞循环Akt和p53的活性。研究发现高浓度的miR-21可抑制PTEN基因，导致肿瘤的增殖、转移和侵入到其他组织[10]。(2)PDCD4(programmed cell death 4)是近年新发现的一种抑癌基因，它的表达产物通过抑制相关基因的转录和翻译，从而抑制肿瘤生成。目前已有多项研究报道了PDCD4有可能成为miR-21潜在的靶点之一，他们发现miR-21在多种肿瘤细胞中过表达，可直接结合TPM1，提示PDCD4有可能成为miR-21的靶基因，miR-21可以通过抑制PDCD4的表达从而促进癌症的发生[11]。(3)TPM1(tropomyosin 1)被认为可以抑制肿瘤的恶性表型。Zhu S等[12]通过实验证明TPM1也是在miR-21的3'-UTR区抑制其表达,而在使用了抗miR-21药物的肿瘤患者中TPM1的表达增加。此外，有研究发现Maspin也有可能是miR-21的作用靶基因[13]。这些基因通过负性调节作用于乳腺癌细胞系，提示miR-21有可能是通过多重抗转移靶基因作用促进肿瘤的侵润和转移。

3.2 miR-155

miR-155在人类多种肿瘤中高度表达，包括乳腺癌[9]。第一次发现miR-155作为人类肿瘤致癌基因是在B细胞性淋巴瘤和慢性淋巴性白血病中高表达[14]。Iorio等采用微阵列和Northern印迹方法发现，与癌旁组织相比，miR-155在乳腺癌组织中高表达从几倍到几十倍。这在之前的研究中也被证实，在正常组织、癌旁组织及肿瘤组织中miR-155的表达量呈现递增趋势[15]。研究发现miR-155通过TGF-β/Smad4路径在正常小鼠上皮细胞中高表达，并且调解TGF-β，从而诱导上皮间叶细胞转化和侵入[16]。为了验证miR-155是否具有介导TGF-β诱导上皮间叶细胞转化的作用，作者发现miR-155在正常小鼠上皮细胞中的异位表达能够破坏细胞间紧密连接和促进细胞的转移。相反抗miR-155在正常小鼠上皮细胞中能够减低TGF-β诱导上皮间叶细胞转化作用。此外miR-155还直接抑制RhoA基因的表达。RhoA是一种调节多种细胞进程的基因，它在细胞交叉点的形成和稳定性方面起着很重要的作用。此外，Jiang S等研究发现SOCS1可能作为miR-155在乳腺癌细胞的靶向基因[17]。作者通过Western blot分析发现与正常对照相比，SOCS1蛋白水平在miR-155高度表达的乳腺癌细胞MCF-7中降低3倍。通过qRT-PCR分析，当miR-155高度表达16倍时，SOCS1 mRNA水平降低30%左右；当用乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞系去敲除miR-155的表达时，发现SOCS1蛋白表达水平增加5倍。提示SOCS1基因有可能是miR-155作用于乳腺癌细胞的靶向基因。

3.3 miR-10b

Ma等[18]在研究中发现miR-10b在乳腺癌组织中高表达，在转移的乳腺癌组织及转移性乳腺癌细胞株中的表达升高更明显,在高转移能力的MDA-MB-231和SUM1315细胞株中miR-10b表达量比正常乳腺上皮细胞高50倍以上。相反,在非转移性乳腺癌细胞株SUM149、SUM159和MCF-7比正常乳腺上皮细胞表达低。Ma等发现，在乳腺癌细胞系中Twist1作为一种促进转移的转录因子,通过与miR-10b发夹结构的上游框架结合，从而激活启动区来调控miR-10b的转录水平；而miR-10b通过调控阻遏抑癌蛋白HOXD10 mRNA的翻译，继而提高细胞转移蛋白RHOC的表达水平。提示 miR-10b有可能是通过 Twist–miR-10b–HOXD10–RhoC路径来调节肿瘤的转移和侵袭能力。

4 在乳腺癌中起到抑癌基因作用的miRNA

在乳腺癌中起到抑癌基因作用的miRNA见表2,其中作用机制研究比较清楚的有miR-206、miR-145、miR-31。

4.1 miR-206

表2 乳腺癌中起抑癌基因作用的miRNA

Iorio MV等利用miRNA微阵列方法比较正常乳腺组织和乳腺癌组织的miRNA的表达情况，发现miR-206有可能作为乳腺癌的抑制基因[15]。Adams BD等研究发现miR-206在雌激素阴性的乳腺癌中高表达，它的调节机制是通过miR-206调节雌激素受体基因ESR1来实现的。最近研究发现miR-206通过在ESR1的3'-UTR区的两个结合位点来抑制ESR1信使RNA的表达[19]。Kondo N等通过RT-PCR方法分析发现miR-206在ERa阳性的乳腺癌组织中低表达[20]。进一步研究发现miR-206只与雌激素受体α阴性的乳腺癌成比例关系，而与雌激素受体β阴性的乳腺癌不成比例关系。刘浩等通过转染miR-206到MDA-MB-231乳腺癌细胞中，48h后Western blot检测转染后乳腺癌细胞中Cdc42蛋白质表达，结果发现miR-206能抑制MDA-MB-231细胞中Cdc42蛋白质的表达和细胞丝状伪足的形成,并且能抑制细胞的侵袭迁移能力[21]。

4.2 miR-145

miR-145在胃癌、膀胱癌、肠癌等多种癌症中已经有报道显示显著下调。顾吉轶等采用一个临床正常乳腺组织(NC)作为对照检测了6例乳腺癌组织和6种乳腺癌细胞系 (MCF-7，ZR-75-30，T47D，MDA-MB-231，MDA-MB-453 ，MDA-MB-435)中miR-145的表达情况，结果发现miR-145在癌组织和癌细胞系中均显著下调，并且具有非常相似的表达模式[22]。miR-145的显著下调表达提示miR-145有可能在肿瘤发生过程中起着非常重要的作用。miR-145转染到MCF-7和MDA-MB-231细胞中，转染过miR-145细胞的侵袭能力都要远远低于转染阴性对照的细胞，细胞数均降低一半以上，这说明miR-145的确对乳腺癌细胞的侵袭有明显的抑制作用。Wang S等通过比较乳腺癌细胞和正常乳腺细胞中miR-145表达含量，结果发现miR-145在乳腺癌细胞MCF-7中低表达，而在正常的乳腺细胞MCF10A中没有低表达。高表达的miR-145能够抑制MCF-7细胞的生长[23]。进一步研究发现，在MCF-7细胞中高表达的miR-145能够降低RTKN蛋白的表达。失调的RTKN能够抑制MCF-7细胞的生长，说明miR-145有可能是通过RTKN抑制乳腺癌细胞的生长。此外，Sachdeva M等转染miR-145到转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和LM2-4142中，分别能降低细胞侵入50%和75%左右。而反义miR-145则能够提高细胞侵入大约50%[24]。通过比较Western blot和免疫荧光分析miR-145在MUC1基因蛋白表达水平，发现miR-145抑制细胞侵入和转移是直接通过MUC1基因来实现的。

4.3 miR-31

美国科学家Valastyan S等发现microRNA-31(miR-31)可同时协调抑制多种靶基因，从而能够同时参与肿瘤侵袭到转移的多个步骤中。作者通过检查15个人类和小鼠乳腺细胞系中的microRNA的表达情况，发现miR-31在正常乳腺细胞中能够表达，在非转移乳腺细胞系的表达轻微减少，在转移性乳腺癌细胞系中表达显著减少。说明miR-31的表达有可能与人类乳腺癌患者的肿瘤转移呈负向联系，而在转移性乳腺癌细胞系中呈低度表达[25]。另外，有数据显示miR-31抑制转移的能力很大一部分应归于它抑制RhoA的能力，RhoA的再表达可部分翻转miR-31的转移抑制作用。为了进一步了解miR-31抑制癌基因的作用机制，作者使用 (PicTar和TargetScan)2种预测miRNA的靶mRNA计算方法，搜索与miR-31相关效应的靶基因。结果发现这些靶基因中的绝大多数是编码与细胞运动过程相关的蛋白，miR-31直接调节了人类 乳 腺 癌 细 胞 内 源 性 的 Fzd3、ITGA5、M-RIP、MMP16、RDX和RhoA表达。只有当多个靶基因同时受到抑制时，miR-31才能显现出最大地抑制转移的能力。所以miR-31抑制乳腺癌细胞转移是多基因共同作用的结果。

5 展望

近些年，对新型出现的miRNA在乳腺癌中的发病机制有了比较深入的了解。各种miRNA在具备相应的生物学特征(如Her2、ER、PR)的乳腺癌正常组织、癌旁组织和癌组织之间研究都比较深入。但是miRNA怎样影响乳腺癌失调的机理，是否改变miRNA的表达就能够改变乳腺癌的病理变化，失调的miRNA怎样影响乳腺肿瘤的转移能力仍然不是很清楚。能够早期发现肿瘤转移的敏感性和特异性都很高的miRNA将是我们不断努力的方向。虽然miRNA作为肿瘤的靶向治疗已经取得了一定的进展，但真正能够很好地运用到临床还有一段很长的路要走。

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