齐墩果酸对食管癌细胞Eca－109的增殖抑制作用

丁玉松，马儒林，杨明，杨倩，张建明，张燕敏

（石河子大学医学院预防医学系，石河子832000）

食管癌（esophageal carcinoma）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其中绝大多数是鳞状上皮癌（95%），食管腺癌甚为少见。当前食管癌的基本治疗策略是手术和放疗、化疗相结合的综合治疗方案。由于食管癌发病较为隐匿，确诊时已多属于中晚期，病灶的扩散和转移使病人失去手术治疗和局部放疗的机会，故化疗已成为延长生存期，改善生活质量的重要手段。但患者在接受抗肿瘤化疗过程中，正常组织细胞也遭受严重损害。人们期望能找到一种既能抗肿瘤，又不过多损害整体健康的内科治疗方法。植物化学物由于其低毒，价廉，副作用少，能减少化疗副作用等，已经越来越多的受到国内外医学界的重视。

OA，又名庆四素，五环三萜类化合物，广泛存在于女贞子、葡萄、白花蛇舌草、夏枯草、大枣、牛膝、西洋参、连翘、山芝麻、甘草等植物中［1］。OA具有多种生物活性，有护肝、解肝毒、降糖、降脂、治疗胃溃疡、抗炎、抗HIV病毒、利尿、抗突变、抗氧化、抗癌等作用［2］。已证实OA对人肺癌、乳腺癌细胞等均具有抑制肿瘤生长的作用。不同肿瘤细胞对不同药物的敏感性差异很大，且国内外尚未见有关OA作用于食管癌Eca－109细胞的相关实验研究报道。

本实验采用不同浓度的OA分别作用于，Eca－109细胞24、48和72 h，观察其对Eca－109细胞株增殖的影响，为食管癌筛选毒副作用小、抗肿瘤活性强的化疗药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株

人食管癌Eca－109细胞株，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

1.1.2药品及主要试剂

OA（购自西安开来生物工程有限公司，纯度98%）；DMEM培养基（GIBCO公司）；小牛血清（杭州四季青生物制品公司）；MTT和二甲基亚飒（DMSO）（北京索莱宝科技有限公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）。

1.1.3主要仪器

CO2培养箱（Thermo Scientific公司）；离心机（上海安亭 TDL－40B）；自动酶标仪（M－K3型酶标仪）；倒置显微镜（MOTIC公司101 mol／L ）；96孔细胞培养板（Corning公司）；高压锅；水浴震荡器；烘箱；分析天平。

1.2 方法

1.2.1实验设计

采用成组设计，分别研究不同浓度OA（5、20、40、80、160、320μg／m L）对食管癌 Eca－109细胞在加药后24、48和72 h的抑制作用。

1.2.2样品溶液的配置

精密称取 OA 0.06 g，用7.5 m LDMSO溶解，轻轻晃动2 min，使OA完全溶解，配制成8 mg／m L的贮备液，分装后低温保存。临用时取400μL贮备液加入9.6 m L的培养液，使其混匀，制成320μg／m L的OA溶液。取320μg／m L的OA溶液5 m L，用培养液稀释两倍得160μg／m L的OA溶液。依次倍比稀释获得80、40、20、10、5μg／m L的 OA 溶液。

1.2.3 MTT试验

将Eca－109细胞接种于50 cm2细胞培养瓶中，加入10%胎牛血清的DMEM在37℃，5%CO2培养箱中常规培养，每2 d换液1次，3～4 d传代取对数生长期的Eca－109细胞经0.25%的胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，再用新鲜培养液稀释成细胞悬液，调整细胞浓度为1×106／m L。

将培养板周边每孔内加100μL PBS防止边缘效应，余下的每孔加100μL培养液。将上述细胞悬液分9组分别接种于96孔培养板中，并设置阴性对照组（加0.5%DMSO，不加OA），每组设6个复孔，每孔细胞数目约7×103个，共接种3个培养板，放入CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后吸去培养液，随机选7组分别加入含 OA 5、10、20、40、80、160、320μg／m L的培养液200μL，另外两组分别为空白组和阴性对照组。各组分别培养24、48、72 h。培养结束前4 h每孔加入20μLMTT。37℃继续孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加入100μLDMSO终止反应，于震荡器上避光震荡10 min，使Formazan颗粒充分溶解。上自动酶标仪测定各孔在波长490 nm处的光密度值（OD值）。以后每隔24 h取出一块96孔板重复以上的操作。

根据OD值计算细胞抑制率，计算公式为：

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 不同浓度OA作用对Eca109细胞增殖的影响

OA作用24、48、72 h候对Eca－109细胞增殖的抑制率与对照组比较OA处理组在较低浓度（5、10、20μg／m L）下均未发现对食管癌 Eca－109细胞有增殖抑制作用，但在较高浓度（40、80、160、320μg／m L）下，均对食管癌Eca－109细胞表现出增殖抑制作用，有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 不同浓度OA作用24、48、72 h候对Eca－109细胞增殖的影响Tab.1 Effect of OA on Eca－109 cell proliferation in different concentration for 24、48 and 72 hours

2.2 OA作用24、48和72 h的重复测量方差分析结果

2.2.1球形检验和剂量主效应方差分析结果

经Mauchly球形检验，本实验数据满足球形假设（P＞0.05），不需要进行校正。进一步比较分析OA不同剂量组药物后发现，剂量因素为主效应时，不同剂量组OA对食管癌细胞株Eca－109的抑制影响差异存在统计学意义（F＝133.230，P＜0.001），除剂量为40μg／m L的实验组与对照组比较时差异无统计学意义（P＞0.05），其余实验组与对照组比较差异均存在显著性（P＜0.05）。证实OA对食管癌Eca－109细胞的增殖有一定的抑制作用。

2.2.2时间因素主效应和时间因素与剂量分组因素交互效应方差分析结果

以时间因素为主效应时，3个不同时点间差异有统计学意义（F＝23.481，P＜0.001）；时间与药物剂量分组存在交互作用（F＝4.776，P＜0.001）；实验药物对食管癌Eca－109细胞的时间、浓度交互作用影响如图1所示。多重比较时，24 h观察点与48 h观察点差异无显著性，其余各时间点差异均有显著性（P＜0.01）。

由时间、浓度交互效应轮廓图（图1）可知：时间为48 h，剂量为160μg／mL是时间—剂量最优组合，此时达到对食管癌Eca－109细胞最大抑制作用。

图1 时间和浓度交互效应轮廓图Fig.1 The combinell effects and interaction for time and corcentration

2.3 OA对人食管癌Eca－109细胞的形态影响

在显微镜下观察，OA作用于人食管癌Eca－109细胞24、48、72 h后的形态见图2～4。

图2～4显示：正常情况下食管癌Eca－109细胞生长良好，形状不规则，呈梭形或多角形，并可融合形成集落，生长有巢状现象（图2a、3a、4a所示）。高浓度用药组的细胞生长明显被抑制，OA作用于人食管癌Eca－109细胞后可见细胞形态变化明显，悬浮细胞增多，细胞浆混浊，细胞胞体缩小、变圆、皱缩、核固缩、碎裂，细胞折光性减弱，细胞内出现颗粒样物质，培养液中有较多的细胞碎片。

图2 不同浓度OA处理24 h后Eca－109细胞形态变化Fig.2 Eca－109 cells morphological changes in different concentrations of OA treatment 24 hours after

图3 不同浓度OA处理48 h后Eca－109细胞形态变化Fig.3 Eca－109 cells morphological changes in different concentrations of OA treatment 48 hours after

图4 不同浓度OA处理72 h后Eca－109细胞形态变化Fig.4 Eca－109 cells morphological changes in different concentrations of OA treatment 72 hours after

3 讨论

目前OA抗肿瘤机制还不十分清楚，有研究者认为可能与以下几个方面有关：（1）抗肿瘤增殖、侵袭、浸润、转移和新生血管形成的作用；（2）诱导肿瘤细胞凋亡；（3）逆转肿瘤多耐药性；（4）增强机体免疫力；（5）保护肝损伤；（6）减轻化疗药物引起的肝损伤等多种生物学活性［3］。目前OA对食管癌Eca－109细胞抑制活性研究报道较少见，其对食管癌Eca－109细胞是否具有抗肿瘤活性尚未见报道。

本实验采用MTT测定OA对食管癌Eca－109细胞的抑制作用，该方法具有简便、快速、灵敏、重复性高、无放射污染、有较好的临床符合性等优点［4］，成为目前最常用的体外肿瘤药敏试验方法。

本实验所选用的人食管癌Eca－109细胞是最早建立的食管癌细胞株，经长期传代仍能保持食管癌的特性，故以人食管癌Eca－109细胞为靶细胞研究齐墩果酸的抗食管癌作用具有较好的代表性。

通过对实验中OD值和公式计算抑制率的结果比较来观察OA对食管癌Eca－109细胞的抑制作用。实验结果表明：OA处理组与对照组比较，在较低浓度下均未发现对食管癌Eca－109细胞有增殖抑制作用，这与李鸿梅等在齐墩果酸对顺铂耐药胃癌SGC－7901细胞增殖的影响及其机制研究中结论相似，即OA在较低浓度下对胃癌SGC－7901细胞未表现出抑制作用［5］。相同时间不同浓度组之间（除外40μg／m L浓度组）的OD值差异均具有显著性（P＜0.001），相同浓度不同时间组之间（除外24 h观察点与48 h观察点）OD值差异也有显著性（P＜0.001）；不同浓度的OA对食管癌Eca－109细胞具有正相关性抑制性，OA分别处理食管癌Eca－109细胞24、48、72 h在40～160μg／mL呈明显的剂量－效应关系。OA在80μg／mL时处理24、48、72 h时呈明显的时间——效应关系。总体趋势是OA对食管癌Eca－109细胞的增殖有抑制作用，其最高抑制率在160μg／m L作用48 h可达87.9%。通过显微镜可以观察到，正常情况下食管癌Eca－109细胞生长良好，形状不规则，呈梭形或多角形，并可融合形成集落，生长有巢状现象。高浓度用药组的细胞生长明显被抑制，OA作用于人食管癌Eca－109细胞后可见细胞形态变化明显，悬浮细胞增多，细胞浆混浊，细胞胞体缩小、变圆、皱缩、核固缩、碎裂，细胞折光性减弱，细胞内出现颗粒样物质，培养液中有较多的细胞碎片。如（图2～4 c、d）。综上所述，OA对食管癌Eca－109细胞具有一定的抑制作用。OA有可能成为治疗食管癌的良好药物，但还需要实验室结果和临床应用的支持和深一步研究。

［1］Mc Laughlin F，Finn P，La Thangue N B.The cell cycle，chromatin and cancer：mechanism－based therapeutics come of age［J］.Drug Discov Today，2003，（8）：793－802.

［2］Jaime A，Rodrlguez Luis A，Guillermo S H.Oleanolic acid promotes healing of acetic acid－induced chronic gastric lesions in rat［J］.Pharmaco.Res，2003，48（3）：291－294.

［3］汤华成，赵蕾，张鹏霞，等.OA对K562细胞系VEGF表达影响的实验研究［J］.中国老年医学杂志，2007，（24）：2371－2373.

［4］Henrik Mueller，Matthias U Kassack，Michael Wiese.Comparison of the usefulness of the MTT，ATP，and calcein assays to predict the potency of cytotoxic agents in various hum an cancer cell lines［J］.J Biomol Screen，2004，9：506－515.

［5］李鸿梅，李雪岩，蔡德富，等.齐墩果酸对顺铂耐药胃癌SGC－7901细胞增殖的影响及其机制研究［J］.中国药理学通报，2009，25（10）：1334－1337.