洋葱总黄酮的大孔吸附树脂纯化工艺

王国军，唐辉，王幻，王鲁石

（石河子大学药学院／新疆特种植物药资源重点实验室，石河子832002）

洋葱（Allium Cepa L.）又名玉葱，球葱，葱头，圆葱等，是百合科葱属；味甘微辛，性温，有平肝、润肺、健胃、解毒、杀虫的功效。洋葱含挥发油、硫化物、类黄酮、甾体皂苷类和前列腺素类等化学成分，有多种药用价值［1］。洋葱与其他葱属植物相比含有更为丰富的黄酮类化合物。不仅如此，在62种常见蔬菜水果中，总黄酮含量也居于首位［2］，这一药食两用的突出特点不容忽视。

黄酮类化合物的作用已被广泛证实，国内外文献报道［3］，不同品种、产地的洋葱中总黄酮含量在50 mg／kg到1300 mg／kg之间。洋葱中的黄酮类成分以槲皮素－3，4'－二葡萄糖苷和槲皮素－4'－葡萄糖苷为主，占到了洋葱总黄酮含量的85%，槲皮素苷的总含量占到了洋葱总黄酮的93%。鉴于其中黄酮成分类别较为单纯，故对于定量洋葱中的总黄酮，用分光光度法测定相对于其他多种分析方法（如HPLC法）更为有效、简便［4］。在提取天然植物中的有效成分时应选择成本低、提取率高、安全性高和无污染的方法。

前期有学者对洋葱总黄酮的成分进行了研究［5］，本实验重点考察制定提取纯化方案。采用应用较为广泛的大孔树脂法对黄酮进行纯化，大孔树脂具有机械稳定性高、吸附选择性好、再生简便、节省费用等优点［6］。但是黄酮类化合物结构复杂、极性各不相同，因此对于洋葱黄酮的分离纯化需要摸索其适合的树脂和工艺条件，并进一步为工业化生产在节约成本、提高安全性方面提供方法和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

UV－2401紫外分光光度计（日本岛津公司），小型打浆机（广东南海钜华电器有限公司），SB－2000型水浴锅（上海爱郎仪器有限公司），电子分析天平（德国赛多利斯）。

80目烘干洋葱粉（甘肃张掖市福联蔬菜脱水厂）；槲皮素对照品（中国生物制品检定所，批号：10081－200406）；AB－8和 D－101型树脂均为南开大学化工厂，其它试剂均为分析醇。

1.2 方法

1.2.1洋葱总黄酮的测定

取洋葱粉100 g加入80%乙醇1000 m L，超声10 min，过滤，再以等量溶剂重复超声提取一遍，滤液合并定容至2000 m L，作为洋葱总黄酮粗提液［7］。利用芦丁作为对照品，以2%AlCl3为显色剂，显色5min后在200～800 nm下进行全波段扫描，确定最大吸收波长为414 nm，选定此波长为测定波长。其线性方程为：A＝0.0375c＋0.0068，R＝0.9999，线性范围：8.1～18.6μg／m L。日内精密度 RSD为0.85%（n＝6）；重复性考察得到RSD 为1.9%；平均回收率为102.7%。该测定方法准确可靠，洋葱粗提液中总黄酮含量为1.14 mg／m L（n＝3，RSD为1.1%），纯度为46.5%，收率是72.1%。

1.2.2树脂的预处理

树脂的预处理分两步，即水合和除去杂质。水合就是把脱水的吸附树脂放在水溶性溶剂（如乙醇、丙酮等）中充分浸泡24 h，以便从孔中赶出气泡，然后用乙醇充分洗涤，直至洗出液与水混合无白色浑浊，最后用去离子水将乙醇洗净。分别用质量分数为5%的HCl和NaOH溶液分别浸泡3 h以除去杂质，最后用去离子水洗至中性。

1.2.3吸附量、吸附率和解吸率的测定

选择适当的乙醇溶液，对吸附了洋葱总黄酮的树脂进行解吸附，按公式计算解吸率。吸附量Qe、吸附率E和解吸率D 的计算公式

其中：Q，n，a为常数；Qe为吸附量；C0为初始浓度；Ce为平衡浓度；V1为加入样品液体积；m为树脂干重；E为吸附率；D为解吸率；CX为洗脱液浓度；V2为洗脱液体积。

1.2.4静态吸附实验

分别称取预处理好的2种大孔吸附树脂10 g（通过含水率换算的干重），置于150 m L具塞锥形瓶中，分别加入50 m L样品溶液，室温下，定时取样进行分析，并按公式计算洋葱总黄酮的吸附量和吸附率。

1.2.5动态吸附实验

在室温下，样品液以一定的流速通过装有树脂的φ2.0×30 cm的玻璃层析柱，测定流出液中洋葱总黄酮的浓度，考察样品液流速对树脂吸附性能的影响，绘制树脂的泄漏曲线，确定最佳的吸附工艺条件。对已吸附样品的树脂进行解吸附实验，考察洗脱剂浓度、流速等对树脂解吸附性能的影响，绘制解吸附曲线，确定最佳的解吸附工艺条件。

2 结果与分析

2.1 静态吸附实验

2.1.1优选合适的吸附树脂

静态吸附实验结果见表1。

由表1可知：2种型号树脂吸附率和解吸率均较好，AB－8型优于D－101型树脂。

表1 两种树脂对洋葱总黄酮的吸附率和解吸附率Tab.1 Adsorption rate of total flavones in onion and desorption rate by 80%ethanol

2.1.2静态吸附动力学特征

准确称取预处理好的AB－8型树脂1.0 g，于50 m L具塞容量瓶中，精确加入一定浓度的供试液，置于恒温振荡器中震荡，每隔一定时间取上清液，进行测定，绘制AB－8树脂静态吸附曲线，结果见图1。

由图1可知：在2 h内基本达到平衡。

图1 AB－8型树脂的静态吸附曲线Fig.1 Static－adsorption dynamic curve of AB－8 resin

2.1.3静态解吸附动力学特征

将吸附饱和的树脂经水洗后移入具塞锥形瓶中，加入80%的乙醇，置于横纹振荡器中解吸附，每隔一定时间取解吸液进行测定，绘制AB－8树脂解吸附曲线，结果见图2。

由图2可知：在20 min左右基本达到解吸附平衡。

图2 AB－8型树脂的静态解吸曲线Fig.2 Static－desorption dynamic curve of AB－8 resin

2.1.4上样液浓度对吸附量的影响

准确称取5份预处理好的AB－8型树脂1.0 g，于50 m L具塞容量瓶中，取5 m L供试品液以水稀释成不同浓度后加入容量瓶中，置于恒温振荡器中震荡2 h后，取上清液进行测定，计算吸附量，结果见图3。

图3 吸附液浓度对吸附量的影响Fig.3 Effect of concentration on adsorption

由图3得知：上样浓度较低时，随浓度的增加吸附率增加。这主要是因为分子越密集，与树脂碰撞的几率越大，吸附量就越大。但是上样浓度过低时，树脂吸附平衡后仍有相当大一部分树脂未达到吸附饱和，树脂使用率较低。若上样浓度过高时，吸附率不再上升，并容易发生絮凝和沉淀，堵塞树脂柱。故确定上样浓度为1～2 mg／m L时达到该树脂的最佳吸附效果。

2.1.5 pH值对树脂吸附性能的影响

准确称取5份预处理好的AB－8型树脂1.0 g，分别加入用0.5%HCl和NaOH溶液调至p H值为2、3、4、5、6的供试液，震荡吸附2 h后，取上清液进行测定，结果见图4。

由图4可见：当p H值低于5时吸附效果好，随着供试液p H值的升高，吸附效果下降，说明洋葱总黄酮在酸性条件下容易被吸附。供试液p H值在2～5之间时树脂的吸附性能较好。但p H值过低时，可能会导致黄酮苷的水解。供试液p H值为4，因此选择在供试品液本身p H值下进行后续实验。

图4 pH值对吸附性能的影响Fig.4 Effect of pH value on adsorption

2.1.6洗脱溶剂浓度的确定

准确称取6份预处理好的AB－8型树脂1.0 g，用一定浓度的供试品溶液使之吸附平衡后，分别用40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，置于恒温振荡器上解吸附2 h，取上清液进行测定，结果见图5。

由图5可见：洗脱剂乙醇浓度低时，洗脱效果较差，随着乙醇浓度的增加，洗脱力增加，当乙醇浓度达到60%后，洗脱率增幅极小。考虑到成本，确定60%乙醇为洗脱剂。

图5 洗脱剂浓度对解析率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on desorption

2.2 动态吸附实验

2.2.1动态吸附曲线

取处理好的树脂10 g装柱，将供试品液以水调制浓度为1.410 mg／m L时上样，每5 m L收集一管，并进行测定，绘制吸附曲线，结果见图6。

由图6可见：初始阶段，流出液的吸光度很小，吸附效率较高，当上样量增加到25 m L时，开始有少量泄露，并逐渐接近饱和吸附，当上样量达到30 m L时，吸附饱和，故选择上样量为3 m L／g树脂。

图6 动态吸附曲线Fig.6 The adsorption curve

2.2.2动态解吸曲线

将一定浓度的供试液上柱，吸附饱和后用60%的乙醇在0.75 BV／h流速下进行洗脱，结果见图7。

由图7可见：用60%的乙醇进行洗脱时，在0.75 BV／h流速下总黄酮出柱较集中。

图7 动态解吸曲线Fig.7 The desorption curve

2.3 验证性实验

为验证优选工艺的可行性，本实验称取200 g处理好的树脂装柱，取浓度为1.512 mg／m L的供试液550 m L上样，上样完毕后用60%乙醇进行解吸，每0.5 BV收集一份。合并含有黄酮的流份，并浓缩至干，称重。经测定总黄酮纯度为69.8%，收率为86.8%。

3 讨论

黄酮类成分在洋葱中含量比较高，有抗病毒、保肝、抗肿瘤等多种药理作用。本实验优选弱极性AB－8树脂富集总黄酮，以便得到含量尽可能高的黄酮类成分做进一步研究。试验中也证明了AB－8型树脂对总黄酮具有较好的吸附和解吸附性能，因此适合对黄酮类成分进行纯化。

本实验考察了吸附率、解析率、吸附液浓度及p H值、洗脱剂浓度等影响树脂吸附性能的主要因素。黄酮类物质大多有酚羟基，有一定的弱酸性，当上样液偏碱性时，可能由于离子化而不被吸附；反之，p H过低时，黄酮类化合物由于转化为佯盐也影响吸附，而且黄酮苷类会水解，因此试验中样品液p H选取为5。吸附流速主要是影响溶质向数值表面的扩散，从而决定了吸附效率，如果吸附流速增大，则溶质分子来不及扩散到树脂内表面，就会发生泄露，吸附效率下降；流速过慢则会延长纯化周期，本实验采用上样流速为1.5 BV／h，洗脱流速为吸附流速的1／2，即0.75 BV／h。

由验证实验可以看出，AB－8树脂处理后的洋葱总黄酮纯度达69.8%、收率为86.8%，和纯化前相比总黄酮的纯度明显提高，富集效果良好。该工艺操作简单、重复性好，可作为洋葱总黄酮的有效富集方法。

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