无机汞诱导人小细胞肺癌NCI＿H446细胞凋亡的分子机制研究

李 丹，于 蕾，袁海波，丁 会＊

（1.吉林大学第一医院 呼吸科，吉林 长春130021；2.吉林大学白求恩医学院 生理学系）

本研究在发现有机汞具有多途径抗癌效应的基础上［1，2］，进一步探讨无机汞对小细胞肺癌（SCLC）细胞系NCI－H446细胞凋亡、凋亡相关基因mRNA转录水平和蛋白质表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人小细胞肺癌细胞株（NCI－H446）由吉林省肿瘤医院肿瘤研究所赠送。无机汞（IM）（德国，Merck公司），As2O3（美国，Alfar Aesar公司），顺铂（DDP）（山东齐鲁药厂）；DMEM细胞培养基（美国，Gibco公司）；TrizolRNA提取试剂盒（上海生物工程公司）；Taq DNA polymerase（大连宝生物工程公司）；AMV逆转录酶（美国，Sigma公司）；Rnasin RNA酶抑制剂（美国，Promega公司）；间隔100bp DNA分子量标尺，Oligo dT寡核苷酸T（大连宝生物工程公司）。

1.2 主要仪器 550型酶标仪，凝胶成像分析系统（美国，Bio－Rad公 司）；PCR 扩 增 仪 （美 国，PE 公司）；FACSAN流式细胞仪（美国，BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞 取对数生长期 NCI－H446细胞，用0.25%胰酶消化，配制成单细胞悬液，调细胞浓度为1×106／ml，接种至6孔培养板（5×105／孔）。细胞分为IM组、As2O3组、DDP组和对照组。待细胞完全贴壁以后，IM组每孔加入终浓度为5.0μmol／L的IM，终体积均为2.0ml；As2O3组、DDP组和对照组分别加入As2O3、DDP及培养液，终体积为2.0 ml。培养6、12、24、48h后，分别收集细胞。

1.3.2 RT－PCR Trizol法提取细胞总RNA 经紫外分光光度计检测RNA纯度良好后，RNA在AMV逆转录酶作用下合成cDNA。再以cDNA作为模板参与完成PCR反应。PCR扩增的条件为：94℃1min，57℃1min，72℃90s，35个循环，最后1次循环结束后，72℃延伸10min。根据基因cDNA序列设计 Bcl－2、Bax、Caspase－3和β－actin的 PCR引物（由上海生物工程公司合成）。Bcl－2引物序列：正向5′CGCTCTGTGGATGACTGAGT3′，反向5′GATTTGACCATTTGCCTGAAT3′，产 物 长 度389bp。Bax引物序列：正向5′ATTGGAGATGAACTGGATAGC3′，反向5′CCACAAAGATGGTCACTG3′，产物长度337bp［3］。Caspase－3引物序 列：正 向 5′GCACTGGAAT－GTCAGCTCGCAA3′， 反 向 5′ GCCACCTTCCGGTTAACACGAC3，产物长度556bp［4］。β－actin引物序列：正向5′TCTGGATCACCTTCTGCTGG3′，反向5′ATTGCTCAGGA－CATTTCTG3′，产 物 长 度 690 bp［5］。PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统分析结果。目的基因的表达水平用其与GAPDH相比较的相对平均灰度值表示。

1.3.3 Western Blot NCI－H446细胞总蛋白的提取及定量 不同浓度（0、2.5、5、10及20μM）IM 处理NCI－H446细胞24h后，分别收集细胞，提取总蛋白。于595nm处测定光吸收值，由标准曲线查出待测样品浓度。经电泳、转膜、免疫反应，经胶片显影，测积分光密度值，分析结果。

2 结果

2.1 流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡的变化 不同浓度（1.25、2.5、5、10及20μM）IM、As2O3和DDP作用NCI－H446细胞24h后，随着剂量的升高可以看到凋亡率有增加的趋势，其中，IM组在浓度小于5.0μM时，早期凋亡率随药物浓度的增加而增高，于5.0μM达到峰值75.28%，IM的浓度超过5.0μM后，早期凋亡率随药物浓度的增加而呈现下降趋势，而晚期凋亡和坏死率逐渐增多。As2O3和DDP也有同样的规律，但其使细胞达到早期凋亡峰值的浓度是10.0μM，且早期凋亡率的峰值在As2O3组为56.87%，DDP组为61.20%，均低于IM（P＜0.001或0.01），其中DDP比 As2O3略高，但无统计学差异。结果见表1－3及图1。

表1 IM作用NCI－H44624h后对细胞凋亡的影响（n＝3，，η%）

表1 IM作用NCI－H44624h后对细胞凋亡的影响（n＝3，，η%）

注：与上一剂量组比较 ＊P＜0.001；▲P＜0.05；□P＜0.01

Late apoptosis Early apoptosis Normal cell Necrotic cell（%）IM（μM）0.0 5.34±0.35 0.09±0.01 94.00±2.1 0.57±0.05 1.25 40.14±1.72＊ 0.69±0.03＊ 55.50±1.68 1.72±0.85 2.5 61.91±2.13＊ 3.85±1.12▲ 32.80±1.68 1.40±0.11 5.0 75.28±1.86＊ 3.79±0.92 19.34±1.13 2.08±0.45 10.0 51.46±2.37 30.84±2.25＊ 12.98±1.59 5.47±1.18▲20.0 18.57±1.06 34.96±1.60□ 1.49±2.26 44.96±2.16＊

表2 As2O3作用NCI－H44624h后对细胞凋亡的影响（n＝3，，η%）

表2 As2O3作用NCI－H44624h后对细胞凋亡的影响（n＝3，，η%）

注：与上一剂量组比较 ＊P＜0.001，▲P＜0.05，▽P＜0.01

As2O3（μM）Early apoptosis Late apoptosis Normal cell Necrotic cell（%）0.0 5.34±0.35 0.09±0.01 94.00±2.1 0.57±0.05 1.25 31.12±2.55＊ 2.52±0.13＊ 65.27±2.34 1.32±0.11▲2.5 42.14±1.14＊ 5.68±1.74 51.08±2.24 2.48±0.13▲5.0 44.98±1.99＊ 4.85±1.72 47.98±2.56 1.89±0.07 10.0 56.87±2.34＊ 8.64±1.21＊ 24.97±1.65 10.78±1.12＊20.0 31.02±1.16 35.13±2.45▽ 5.23±2.75 30.10±1.23＊

表3 DDP作用NCI－H44624h后对细胞凋亡的影响（n＝3，，η%）

表3 DDP作用NCI－H44624h后对细胞凋亡的影响（n＝3，，η%）

注：与上一剂量组比较 ＊P＜0.001；▲P＜0.05

DDP（μM）Early apoptosis Late apoptosis Normal cell Necrotic cell（%）0 5.34±0.35 0.09±0.01 94.00±2.1 0.57±0.05 1.25 29.15±1.97＊ 2.62±1.02 67.32±2.56 21.25±1.62＊2.5 42.45±2.11＊ 5.16±2.34 48.47±2.21 4.79±1.83 5.0 48.78±2.67＊ 7.76±2.23 33.45±2.74 11.32±1.56▲10.0 61.20±2.21＊ 10.84±1.23 18.75±1.18 11.04±1.38 20.0 21.02±1.78 37.86±2.11＊ 3.16±0.09 38.27±1.69＊

图1 IM、As2O3、DDP 作用 NCI－H446 24h后对早期细胞凋亡的影响

2.2 细胞凋亡相关基因转录水平的变化 采用RT－PCR方法检测5μM IM作用NCI－H446细胞6－48h后Bax mRNA水平的变化。结果显示：IM组细胞Bax mRNA及Caspase－3mRNA水平高于对照组（P＜0.001），存在着时间依赖性增高趋势，至24h达到最高；而Bcl－2mRNA水平低于对照组（P＜0.001），存在着时间依赖性降低趋势，至24h达到最低。结果见表4。

表4 经5μmol／L IM处理后不同时间点NCI－H446细胞中Bax、Bcl－2及 Caspase－3mRNA 水 平 与 β－actin水 平 的比值（n＝3，）

表4 经5μmol／L IM处理后不同时间点NCI－H446细胞中Bax、Bcl－2及 Caspase－3mRNA 水 平 与 β－actin水 平 的比值（n＝3，）

＊P＜0.001vs control group

Time（h） Bax mRNA Bcl－2mRNA Caspase－3mRNA 0 0.55±0.010 1.40±0.024 0.47±0.025 6 0.85±0.028＊ 1.19±0.020＊ 0.66±0.035＊12 1.14±0.059＊ 1.10±0.018＊ 1.22±0.080＊24 1.66±0.030＊ 0.95±0.021＊ 1.42±0.025＊48 0.69±0.023＊ 0.91±0.014＊ 1.09±0.013＊

2.3 Western Blot法检测 Bcl－2、Bax、Caspase－3蛋白水平变化 采用Western Blot法检测不同浓度（0、1.25、2.5、5及10μM）IM 作用 NCI－H446 24h后，细胞凋亡抑制基因Bcl－2、凋亡促进基因Bax、Caspase－3蛋白水平变化。结果显示：IM各浓度组细胞Bcl－2蛋白水平均低于对照组，且存在着浓度依赖性降低趋势；IM各浓度组细胞Bax蛋白水平均高于对照组，且存在着浓度依赖性增高趋势；各组均可见32kDa的Caspase－3蛋白酶原表达，各实验组在17kDa处可见一裂解的小片段，并随剂量的加大颜色逐渐加深，对照组未检测到17kDa的小片段，表明在IM的作用下Caspase－3蛋白酶原被剪切活化。

3 讨论

本实验选择有开发潜力的IM作为研究对象，选择疗效肯定的顺铂（DDP）和同样具有剧毒的三氧As2O3为对照，探讨IM诱导细胞凋亡的作用及机制。结果表明，IM诱导小细胞肺癌细胞凋亡与As2O3和DDP有同样疗效，且有较低使用浓度和高的早期凋亡率。理想抗癌药就是以最小的剂量产生最大的疗效，诱导细胞产生凋亡而不是坏死。因此IM具备这样的条件，可能成为最有开发潜力的抗癌药物之一。杨惠芬等［6］通过比较氯化汞（HgC12）和As2O3的诱导凋亡作用也证实，汞的诱导凋亡和杀死细胞能力强于砷。哈尔滨医科大学最早生产的癌灵1号（713注射液）以As2O3和HgC12为主要成份。1990年后，因为HgC12不易溶于水，且测不出其浓度，所以不再加入制剂中。然而，去HgC12后，抗癌作用减弱。

细胞凋亡是一个复杂、精密的过程，在诸多调控凋亡的信号转导途径中，线粒体跨膜电位崩解是细胞凋亡特异性早期指标之一，这是由于其通透性转换孔（permeability transition pore，PTP）开放引起线粒体通透性转换的直接后果。本研究检测了调控PTP开放和关闭的两个关键基因Bcl－2和Bax在mRNA及蛋白水平的变化，显示IM组细胞凋亡抑制基因Bcl－2mRNA及蛋白表达水平均低于对照组，而凋亡促进基因Bax mRNA及蛋白表达水平均高于对照组。说明IM在上述基因的转录翻译过程中有重要调控作用。Bax相对量高于Bcl－2，Bax同二聚体的数量增多，促进了PTP的开放，启动了细胞凋亡的线粒体途径，加速了细胞凋亡［7］。此外，蛋白酶家族Caspase在凋亡程序的启动及执行过程中发挥了非常重要的作用。故本实验检测了最具代表性的 Caspase－3蛋白水平的变化，显示IM 组Caspase－3mRNA水平高于对照组，说明IM在转录水平调控了该基因的表达；Western blot结果显示随着浓度的增加，凋亡的进展，活性酶亚基P17的产生愈来愈多，说明IM可使翻译后酶前体活化，即IM在双重水平上调控了Caspase－3。当浓度达到10μmol／L时，活性酶亚基P17却呈下降趋势，这是因为坏死细胞增加，使 Caspase－3的活性下降［8］。上述实验结果说明IM诱导NCI－H446细胞凋亡是通过调控凋亡相关基因表达实现的。它下调Bcl－2表达、上调Bax表达，使得Bcl－2／Bax比例降低，使得PTP孔不可逆的开放，线粒体膜外的小分子可以进入到膜内，使线粒体膜电位消失，外膜破坏，经系列反应进而活化Caspase－3，使其不能修复损伤的DNA，进而细胞发生凋亡。

综上所述，IM在诱导细胞凋亡方面与As2O3和DDP作用相同，但在同等剂量下，IM作用强于后两者，如果结合它的挥发性，则将是吸入治疗中心型肺癌的理想用药，故IM可能成为最有开发潜力的抗癌药物之一。

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