AP－2α对基质金属蛋白酶－20作用的研究

赵 娜，王玉民，孙学玲，曲 正，孙 岩，张娟娟，高玉光

(山东:1.潍坊医学院口腔医学研究所，潍坊 261053;2.山东大学附属齐鲁医院口腔科，济南 250012;3.滨州医学院附属医院口腔科，滨州 256603)

AP－2(Activating protein－2，AP－2)是一类具有细胞类型特异性结合DNA的转录因子家族，在哺乳动物胚胎发育和细胞生长、分化以及凋亡中起重要的作用［1］。金属基质蛋白酶－20(matrix metalloproteinase 20，MMP20)主要在成釉细胞分泌期降解釉质蛋白，是一种牙齿特异表达的基质金属蛋白酶，与釉质发育密切相关。分析发现MMP－20基因启动子区含有AP－2结合位点，而且AP－2转录因子家族中 AP－2α 在成釉细胞中表达最强［2－3］，本研究拟运用生物信息工具分析与MMP－20启动子特征性序列相互作用的转录因子AP－2α，并通过一系列实验探讨AP－2α对MMP－20基因表达的影响，为进一步研究釉质发育过程中的基因表达调控奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料

UNIQ－10柱式DNA胶回收试剂盒、UNIQ－10柱式质粒小量抽提试剂盒、UNIQ－10柱式PCR产物纯化试剂盒(Bio Basic Inc公司，美国);PrimeSTAR HS DNA Polymerase、RNAiso Plus、PrimeScript® RT reagent Kit、siRNA－AP－2α(TaKaRa，日本);HindⅢ、XbaⅠ、BstxI、XhoI、MluI(NEB 公司，美国);Trans-Fast TMTransfection Reagent、Dual－Luciferase® 双萤光素酶报告基因检测系统(Promega公司，美国);SYBR Green PCR Master Mix(Roche公司，瑞士)，反转录试剂盒、DNA Marker#SM0331(Fermentas公司，美国);胎牛血清 (杭州四季青公司)，胰蛋白酶、DMEM培养基(Hyclone公司，美国)，IQ5TM PCR仪(Bio－Rad公司，美国);Protein A Agarose beads(Upstate公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠 AP－2α 基因克隆及重组质粒 pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 的构建

小鼠成釉细胞系为日本秋田大学Sugiyama等馈赠。将传至第三代的成釉细胞用RNAiso Plus提取Total RNA，再用M－MLV RTase cDNA Synthesis Kit(宝生物)合成cDNA(小鼠总DNA)作为PCR的模板。根据Genbank中公布的小鼠AP－2α基因序列及引物设原则，利用Primer primer 5.0进行引物设计。上游:5'－GGAAGCTTGGATGTTAGTTCACAGTT－3'(HindⅢ);下 游:5'－GCGGTCTAGACTTTCTGTGTTTCTC－3'(XbaI)，由宝生物工程(大连)有限公司合成。预扩增AP－2α mRNA的1293个碱基DNA片段，PCR反应条件为35个循环:98℃ 10 s，59℃ 15 s，72℃ 3 min。经双酶切、连接、转化等构建重组质粒pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α，并进行酶切及测序鉴定(南京金斯瑞公司)。正确者命名为 pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α。

1.2.2 RNA 干扰阻断 AP－2α 表达时 AP－2α 和MMP－20 mRNA 的表达

依据Elbashir等提出的小干扰RNA设计原则设计一对靶向AP－2α基因的特异性双链 siRNA(siRNA－AP－2α)。HPLC 级别纯化的双链 siRNA和作为RNA干扰阴性对照的一对无关siRNA均在TaKaRa公司合成。以双链siRNA瞬时转染60 h后的成釉细胞总RNA逆转录的cDNA为模板，进行实时定量PCR。引物序列:内参对照GAPDH，F:5’－TGTGTCCGTCGTGGATCTGA－3’;R:5’－TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG － 3’;MMP20， F:5’－GGCGAGATGGTGGCAAGAG－3’;R:5’－CTGGGAAGAGGCGGTAGTT－3’;AP－2α，F:5' －GGAGAGCGAAGTCTAAGAATGG－3’;R:5’－TAGTGACGTGAGGAGGGTAACG－3’。反应条件 94℃4 min，94 ℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 25 s，80℃ 15 s采集荧光，40个循环后72℃延伸1 min。反应在IQ5TMPCR仪进行，每个样本3个复孔，重复3次。CT值由荧光PCR仪在扩增过程中自动读出，所得CT值结果进行2－△△ CT分析［5］。

1.2.3 AP－2α 不同剂量过表达时对 MMP－20 基因启动子转录活性的影响

成釉细胞长至70% ～80%汇合时，按照Trans-FastTM Transfection Reagent说明书进行转染。成釉细胞中转染空质粒pcDNA 3.1/myc－hisA作为阴性对照，pRL40质粒作为内参照，实验分为5组，组1:10 ng pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 质粒，390 ng空质粒 pcDNA 3.1/myc－hisA;组 2:50 ng pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 质粒，350 ng空质粒pcDNA 3.1/myc－hisA;组3:100 ng pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 质粒，300 ng 空质粒 pcDNA 3.1/myc－hisA;组4:400 ng pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 质粒，0 ng空质粒 pcDNA 3.1/myc－hisA;组 5:0 ng pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 质粒，400 ng空质粒pcDNA 3.1/myc－hisA。每组各加入构建的pGL3 －MMP－20(511 bp)质粒400 ng。参照 Dual－Luciferase®双萤光素酶报告基因检测系统检测萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)激发底物释放荧光的数值(U1)及海肾荧光素酶(Renilla luciferase)激发底物释放荧光的数值(U2)。以每一样品所测U1/U2之比为该质粒报告基因的荧光素酶相对活性。每组3个复孔，重复3次。根据此实验检测结果，将均转染 pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 400 ng者用于后续实验。

1.2.4 AP－2α 过表达时不同长度 MMP－20 基因启动子转录活性变化

按照TransFastTM Transfection Reagent说明书进行重组质粒pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α 瞬时转染小鼠成釉细胞。以转染空质粒pcDNA 3.1/myc－hisA的成釉细胞作为阴性对照(control)，pRL40质粒作为内参照，实验分为10组，组1:400 ng空质粒 pcDNA3.1/myc－hisA+400 ng pGL3 －MMP－20(102bp);组 2:400 ng空质粒 pcDNA3.1/myc－hisA+400 ng pGL3－MMP－20(197bp);组 3:400 ng空质粒 pcDNA3.1/myc－hisA+400 ng pGL3－MMP－20(394 bp);组 4:400 ng 空质粒 pcDNA3.1/myc－hisA+400ng pGL3－MMP－20(511bp);组 5:400ng空质粒 pcDNA3.1/myc－hisA+400ng pGL3－MMP－20(1200 bp);组6:400 ng pcDNA 3.1/myc－HisA－AP－2α +400 ng pGL3－MMP－20(102bp);组7:400ng pcDNA3.1/myc－HisA－AP －2α +400 ng pGL3－MMP－20(197bp);组 8:400 ng pcDNA3.1/myc－HisA －AP－2α +400ng pGL3－MMP－20(394bp);组 9:400 ng pcDNA3.1/myc－HisA －AP－2α +400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)，组 10:400 ng pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α +400 ng pGL3－MMP－20(1200 bp)。参照 Dual－Luciferase® 双萤光素酶报告基因检测系统(Promega公司)进行检测。本研究每组3个复孔，重复3次。根据此实验检测结果，后续实验将对MMP－20启动子511 bp(－488～+23)片段进行研究。

1.2.5 染色体免疫共沉淀技术研究 AP－2α 与MMP－20启动子的相互作用

成釉细胞无血清DMEM培养48 h后，400 nmoL/L PMA刺激30 min。细胞经甲醛交联后，以每5管大约3×107个细胞分装。SDS Lysis Buffer裂解细胞并进行超声处理(200 bp～1000 bp)(取部分用于Input)后，加入适量含1 mmoL/L PMSF的ChIP Dilution Buffer进行稀释，使最终OD260为2。实验组按浓度1∶500滴加兔抗鼠AP－2α抗体(Santa Cruz公司)，同时IgG组滴加等浓度的羊抗兔无关抗体，阴性对照不加任何抗体，4℃孵育过夜。实验组和对照组分别加入适量Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA，在4℃孵育60 min后，对沉淀进行洗涤并用Elution buffer洗脱。经逆转交联及蛋白消化后，以纯化DNA片段为模板进行PCR反应。利用TFSEARCH、AliBaba 2.1 工具分析得到 AP－2α 与MMP－20结合的特征性序列GCCTGTGGG，对预测的结合位点设计一对引物:上游:5’－ATGTAGGTCCTGGGGAATGAAC－3’，下 游:5’－GCTATGTACAGAAATTGGTATGAGC－3’，预扩增片段为183 bp(大连宝生物公司合成)。分别用 1、2、5、8 μL 的 Input作为模板摸索出相应的PCR条件，并选择一组效果较好的用于最终的PCR检测。PCR反应条件为35个循环:94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 20 s。PCR反应结束后，取10 μL反应液进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察并拍照。

1.2.6 小鼠 MMP－20基因启动子特征性序列的定点突变

根据以上实验结果并利用生物信息工具，将特征性序列GCCTGTGGG定点突变为GTTTGTAAG，并设计突变引物，上游:5’－GCTTGTTTGTAAGTGCAAATAAAGAG－3’，下游:5’－CTGATGACCTGGGTTCATTCC－3’(大连宝生物公司合成)。然后以本实验室提供的重组质粒 pMD18－T－MMP－20(－488～ +23，511bp)为模板，按照 TaKaRa MutanBEST Kit说明书进行定点突变，并构建小鼠pGL3－MMP－20突变质粒。通过单酶切(MluI酶)和DNA序列分析(南京金斯瑞公司完成)进行鉴定，正确者命名为pGL3－MMP－20突变体。

1.2.7 AP－2α过表达及RNA干扰阻断其表达时野生型和突变型MMP－20基因启动子转录活性变化

重组质粒 pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 瞬时转染小鼠成釉细胞。pRL40质粒作为内参照，将实验分为 4组，组 1:400 ng空质粒 pcDNA 3.1/myc－hisA+400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)野生型;组2:400 ng pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α +400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)野生型;组 3:400 ng空质粒 pcDNA3.1/myc－hisA+400 ng pGL3 －MMP －20(511 bp)突变型;组4:400 ng pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α +400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)突变型。每组3个复孔，重复3次。继续培养30 h后，双荧光素酶报告基因检测系统检测。

双链siRNA瞬时转染小鼠成釉细胞，48 h后进行野生型MMP－20基因启动子和突变型MMP－20基因启动子瞬时转染。pRL40质粒作为内参照，将实验分为4组，组1:无关siRNA转染情况下400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)野生型;组 2:双链siRNA转染情况下400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)野生型;组 3:无关 siRNA转染情况下 400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)突变型;组4:双链 siRNA转染情况下400 ng pGL3－MMP－20(511 bp)突变型。每组3个复孔，重复3次。继续培养36 h后，双荧光素酶报告基因检测系统检测。

1.3 统计分析

采用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，组间比较用配对t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 小鼠AP－2α 基因的克隆

小鼠AP－2α基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，该条带大小与目的片段的大小一致(图1a)。重组质粒 pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α的酶切鉴定如图1b所示:单酶切所得片段大小为6719 bp;双酶切释放的片段为1396 bp，余下的片段为5323 bp，与预测结果一致。经初步鉴定正确的重组质粒 pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 送由金斯瑞公司进行序列分析，得到的基因测序结果经BLAST分析后，与GenBank中登录基因序列完全一致，无点突变及移码突变发生(图1c)。

2.2 RNA 干扰阻断 AP－2α 表达时 AP－2α 和MMP－20 mRNA表达变化

成釉细胞中转染无关siRNA和siRNA－AP－2α后，60 h时发现AP－2α mRNA表达水平后者比前者下降约30%，表明AP－2α siRNA对AP－2α基因表达的干扰效果较好(P＜0.05);MMP－20 mRNA 表达水平后者比前者上升1.9倍，表明小鼠转录因子AP－2α对MMP－20的表达有抑制作用(P ＜0.05)(图2)。

2.3 AP－2α 不同剂量过表达时对 MMP－20基因启动子转录活性的影响

随着AP－2α转染剂量的增长，MMP－20启动子的荧光素酶活性明显减弱，说明小鼠转录因子AP－2α对MMP－20的表达有抑制作用，并且AP－2α在转染400 ng时对MMP－20启动子表达的抑制作用最强(P ＜0.05)(图 3a)。因此，将均转染 pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 400ng用于后续试验。

在检测转录因子AP－2α过表达时不同长度小鼠MMP－20基因启动子转录活性变化发现，400 ng pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 转染细胞后，与 pcDNA3.1/myc－hisA 比较，小鼠转录因子 AP－2α 对MMP－20启动子(－488～+23)511 bp片段的表达抑制作用最明显(P＜0.05)(图3b)。因此，后续实验将对MMP－20启动子511 bp片段进行研究。

2.4 AP－2α 与 MMP－20 启动子的相互作用

超声结束后，取少量进行琼脂糖凝胶电泳，观察超声处理对于基因组DNA的剪切效果。如图4a所示，DNA大部分已断裂成200～1000 bp大小的片段，可继续下步实验。染色体免疫共沉淀实验结果扩增出大小为183 bp的片段，显示模板中含有预测的结合位点，表明小鼠MMP－20启动子序列与AP－2α可能在此位点结合(图4b)，并为特征性序列的定点突变提供依据。

2.5 AP－2α过表达及RNA干扰阻断其表达时野生型和突变型MMP－20基因启动子转录活性变化

以实验室提供的重组质粒pMD18－T－MMP－20(－488～+23，511bp)为模板，将特征性序列GCCTGTGGG定点突变为 GTTTGTAAG，PGL3－MMP－20(511 bp)构建突变质粒，经酶切和DNA序列分析进行鉴定，突变体在预期位点发生突变(图5a)。

pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 400 ng转染细胞后检测结果显示，与pcDNA3.1/myc－hisA比较，野生型 pGL3－MMP－20(511 bp)比突变型pGL3－MMP－20(511 bp)荧光素酶活性下降率高(P＜0.05)，表明对特征性序列进行突变后，AP－2α对MMP－20启动子511 bp片段的表达几乎无抑制作用(图5b)。成釉细胞中转染siRNA－AP－2α后检测结果显示，与无关siRNA相比较，野生型pGL3－MMP－20(511bp)表达水平升高，而突变型pGL3－MMP－20(511 bp)表达水平则降低(P ＜0.05)。不仅表明 AP－2α siRNA 对AP－2α 基因表达的干扰效果较好，消除了AP－2α对MMP－20启动子的抑制作用;而且表明了特征性序列突变后，AP－2α siRNA 对 MMP－20启动子的表达水平无显著影响(图5c)。再一次证明了转录因子AP－2α通过与MMP－20基因启动子特征性序列相互作用，从而抑制MMP－20表达。

图1 小鼠AP－2α基因的克隆

图2 RT－PCR检测RNA干扰阻断转录因子 AP－2α 表达时 AP－2α 和 MMP－20 mRNA的表达

图3 双荧光素酶报告基因检测AP－2α不同剂量过表达时不同长度MMP－20基因启动子转录活性变化

图4 染色体免疫共沉淀研究AP－2α与MMP－20启动子的相互作用

图5 双荧光素酶报告基因检测系统检测野生型(WT)和突变型(MUT)MMP－20基因启动子转录活性

3 讨论

基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)是一个大家族，是自然进化中高度保守的一类酶，参与降解包括骨在内的全身各种组织细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的蛋白酶家族。其中MMP－20的表达始于釉质分泌的早期阶段，是降解釉质基质蛋白的主要蛋白酶［2－3］，能促进羟基磷灰石的沉积，利于釉质的矿化。

AP－2是一类具有细胞类型特异性结合DNA的转录因子家族，通过激活基因选择性地表达，参与一系列细胞生命活动，如细胞增殖、分化、凋亡的调控;在哺乳动物的胚胎发育过程中也扮演重要角色。到目前为止，在人类和小鼠中已经发现5个AP－2 家族成员，分别为 AP－2α，AP－2β，AP－2γ，AP－2δ and AP－2ε［1］，其中 AP－2 转录因子能双向调节基因转录表达。AP－2通过调控这些基因的转录活动，影响细胞生命活动、细胞间稳态、胚胎发育等［2］。在 AP－2 家族中，AP－2α (activating protein)发现最早，是转录因子AP－2家族中的重要一员，在哺乳动物胚胎发育和细胞生长、分化和凋亡中起重要的作用［3－5］，其抑癌效应也最为明确。敲除AP－2α基因的小鼠，可导致神经管、面部、眼和四肢的胚胎形成受到影响［2］。国内外对小鼠AP－2的研究多集中在癌症方面，而关于AP－2对釉质的影响目前尚无较多报道，该方面的研究将是探讨由MMP－20基因引起釉质发育疾病的一个重要切入点。本实验室在对小鼠成釉细胞内AP－2家族成员进行研究的过程中发现，AP－2α的表达最强，因此本实验选用AP－2α进行深入研究，探索其对MMP－20的调节作用，从而对釉质发育的影响。

本研究对小鼠AP－2α基因克隆后，进行RNA干扰阻断转录因子AP－2α表达，通过RT－PCR检测发现小鼠转录因子AP－2α对MMP－20的表达有抑制作用。再利用双荧光素酶报告基因检测系统，检测出小鼠转录因子AP－2α在转染400 ng时对MMP－20启动子表达的抑制作用最强，并且在转染400 ng时对MMP－20启动子511 bp片段的表达抑制作用最明显。根据此实验检测结果，将均转染pcDNA3.1/myc－HisA－AP－2α 400 ng者用于后续实验，并进一步对MMP－20启动子511bp(－488～+23)片段进行深入研究。利用染色体免疫共沉淀技术验证了AP－2α可能与MMP－20启动子特征性序列结合，调控MMP－20表达;进行小鼠MMP－20基因启动子特征性序列的定点突变，利用双荧光素酶报告基因检测系统检测AP－2α过表达和RNA干扰阻断转录因子AP－2α时野生型和突变型MMP－20基因启动子转录活性，结果进一步说明了转录因子AP－2α通过与MMP－20基因启动子特征性序列相结合，从而抑制MMP－20表达。本结果提示，小鼠AP－2α转录因子可与成釉细胞内MMP－20启动子的特征性序列相互作用，从而调控MMP－20的表达水平，在釉质形成过程中发挥作用，对于釉质疾病的预防及治疗具有潜在的指导意义。

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