溴乙锭对出芽短梗霉的诱变作用

胡洪森，叶 斌

（武汉生物工程学院生物技术系，湖北 武汉 430415）

溴乙锭对出芽短梗霉的诱变作用

胡洪森，叶 斌

（武汉生物工程学院生物技术系，湖北 武汉 430415）

采用溴乙锭对出芽短梗霉进行诱变，得到一株不产色素的变异菌种BM2－5，液体发酵细胞全部呈酵母态，在以大米酶解葡萄糖为碳源的液体培养基中于27℃、200 r·min－1摇瓶培养72 h得到白色的普鲁兰粗多糖，最高产量达68.06 g·L－1。

出芽短梗霉；诱变；溴乙锭；普鲁兰

普鲁兰（Pullulan）是由α－1，4糖苷键形成的麦芽三糖和极少量麦芽四糖以α－1，6糖苷键连接而成的直链多糖，在出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）的培养物中被发现并分离提纯出来［1］。普鲁兰为白色非结晶粉末，易溶于水，安全无毒，低热值，具有可塑性好、成膜性好、膜隔气性好等特性，在医药、食品、化妆品、生物医学等领域有广泛的应用前景［1，2］。对普鲁兰进行化学修饰，根据不同需要制备普鲁兰衍生物，可进一步拓展普鲁兰的应用范围［3］。

出芽短梗霉在产生普鲁兰多糖的同时也产生色素，使多糖提纯困难。目前，已有分离［4］、诱变［5，6］低产色素或不产色素菌株以及菌株发酵条件［7～9］的报道，但尚未见工业化应用。溴乙锭诱导酵母细胞产生限制线粒体呼吸作用的变异菌株［10］，增加酵母态细胞数量［11］，能有效提高普鲁兰多糖的合成效率，溴乙锭在诱变处理中对细胞无致死作用，不改变细胞代谢途径。作者采用溴乙锭对出芽短梗霉进行诱变处理，得到一株变异菌株，并研究了其产普鲁兰粗多糖情况。

1 实验

1.1 菌种

出芽短梗霉3.2756，由武汉生物工程学院发酵工程实验室提供。

1.2 培养基及培养方法

PDA培养基：马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1000 m L。

改良PDA培养基：马铃薯（去皮）100 g，葡萄糖10 g，琼脂15 g，水1000 m L。

液体培养基：葡萄糖2.5～10 g，（NH4）2SO40.1 g，K2HPO40.2 g，酵母膏0.04 g，NaCl 0.1 g，Mg－SO4·7 H2O 0.04 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，加水至100 m L，p H 值6.5，0.1 MPa灭菌15 min。

培养方法：培养温度为（27±2）℃，斜面活化和平板培养用PDA培养基，斜面培养48 h后4℃冰箱保存。用含葡萄糖2.5%的液体培养基试管培养48 h后，接入装有45 m L含葡萄糖10%的液体培养基的250 m L三角瓶中，接种量2%，200 r·min－1摇瓶培养24 h。

1.3 诱变处理

取摇瓶培养液10 m L，加入到90 m L含40μg溴乙锭的液体培养基中，25～27℃下分别：（1）200 r·min－1培养4 h；（2）200 r·min－1培养4 h后静置48 h。将培养液用生理盐水梯度稀释，取稀释度为10－3、10－4、10－5、10－6的培养液涂布平板，菌落编号转入斜面培养。

1.4 粗多糖的提取

取发酵液于4000 r·min－1离心30 min，分离菌体，上清液加入3 BV乙醇沉淀，于3000 r·min－1离心15 min，沉淀用去离子水溶解后再用3 BV乙醇沉淀，过滤烘干至恒重，得普鲁兰粗多糖。菌体用去离子水洗涤，再用0.45μm膜过滤，滤渣用去离子水洗涤，烘干至恒重为菌体干重。按下式计算多糖转化率：

2 结果与讨论

2.1 出发菌株的培养与优化

不同的出芽短梗霉菌株菌落外观、发酵液和多糖的色泽各有不同［12］，普遍认为菌株3.2756、3.3984有较好的产普鲁兰潜力。出芽短梗霉生长过程有多种细胞形态［13］，酵母态细胞是生成普鲁兰的主要细胞形态［14］。

菌株3.2756液体培养形成菌丝和大小不一的酵母态细胞，并形成菌丝团和菌体球，表面覆盖粘状物，摇瓶培养120 h后，平板培养菌落表面皱缩，即开始生成厚垣孢子。

液体培养普鲁兰粗多糖产量随葡萄糖含量增加而升高，粗多糖转化率随葡萄糖含量不同而变化。用含葡萄糖10%的液体培养基培养72 h，粗多糖产量最高为11.07 g·L－1（图1）。发酵液深褐色至黑色，发酵终p H值2.5～2.7，粗多糖黑色。

对菌株3.2756用PDA平板反复分离筛选，得到一株自然突变株BE1－6，菌落由初期的深褐色逐渐变为深黄绿色至黑色，之后全部转化为黑色。摇瓶培养酵母态细胞增加，发酵液灰白色，发酵终p H值4.5～4.7，粗多糖黑色。用含葡萄糖10%的液体培养基培养，粗多糖产量27.13 g·L－1。

图1 菌株3.2756培养时间与菌体干重及粗多糖产量的关系Fig.1 The relationship between culture time and dry cell weight，crude polysaccharide production for strain 3.2756

2.2 溴乙锭诱变处理结果

将菌株BE1－6用溴乙锭诱变处理，（1）法处理获得菌株粗多糖产量比BE1－6略高，其它无明显差异；（2）法处理后分离得到一株变异株BM2－5，菌落呈白色，有时泛浅粉红色，4℃保藏7 d后逐渐出现黑色，1个月后菌落全部转变为黑色。用改良PDA培养基保藏，菌落出现黑色时间推迟。菌株BM2－5发酵液细胞全部为酵母态，细胞大小不到原酵母态细胞的1／10，发酵液白色，发酵终p H值4.5～4.7，粗多糖白色。用含葡萄糖10%的液体培养基培养，粗多糖产量47.82 g·L－1。用不同含量葡萄糖发酵，多糖转化率差异不明显。连续培养8次以上，粗多糖产量差异不明显。3株菌的特征及粗多糖产量比较见表1。

表1 不同菌株的特征及粗多糖产量比较Tab.1 The comparison of characteristic and crude polysaccharide production of different strains

2.3 诱变菌株BM2－5发酵产糖结果

以大米酶解葡萄糖为碳源或以玉米浆代替酵母膏，多糖产量均有提高。菌株BM2－5在大米酶解葡萄糖10%、（NH4）2SO40.1%、K2HPO40.2%、玉米浆0.1%、NaCl 0.1%、MgSO4·7H2O 0.04%、FeSO4·7H2O 0.001%、自然p H 值的培养基中，200 r·min－1摇瓶培养72 h，粗多糖产量最高，为66.37 g·L－1。

菌株用改良PDA培养基保藏时间不超过5 d、活化斜面保藏时间不超过24 h，200 r·min－1摇瓶培养72 h，粗多糖产量最高，为68.06 g·L－1（图2）。

图2 菌株BM2－5培养时间与菌体干重及粗多糖产量的关系Fig.2 The relationship between culture time and dry cell weight，crude polysaccharide production for strain BM2－5

用2 L发酵罐装料1 L，培养基为淀粉糊精（DE35）10%、K2HPO40.2%、蛋白胨 0.2%、NaCl 0.1%、MgSO4·7H2O 0.04%，在通风量为0.5 L·min－1、搅拌转速为350 r·min－1、（27±1）℃、罐压为0.1～0.65 kPa的条件下，粗多糖产量为47.8 g·L－1。

3 结论

在自然育种的基础上用溴乙锭对出芽短梗霉进行诱变，得到菌落及细胞外观差异明显、普鲁兰粗多糖产量大幅提高的诱变株BM2－5，在大米酶解葡萄糖10%、（NH4）2SO40.1%、K2HPO40.2%、玉 米 浆0.1%、NaCl 0.1%、MgSO4·7H2O 0.04%、FeSO4·7H2O 0.001%、p H 值自然的培养基中，摇瓶培养72 h，得到白色的粗多糖，产量最高为68.06 g·L－1。

［1］ Leathers T D.Biotechnological production and applications of pullulan［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2003，62（5－6）：468－473.

［2］ 曹新志.普鲁兰的生产与应用研究进展［J］.四川理工学院学报（自然科学版），2006，19（4）：60－62.

［3］ Shingel I.Current knowledge on biosynthesis，biological activity，and chemical modification of the exopolysaccharide，pullulan［J］.Carbohydr Res，2004，339（3）：447－460.

［4］ 谷才恩.短梗茁霉胞外多糖的研究Ⅰ.菌种的筛选［J］.微生物学通报，1985，12（2）：67－69.

［5］ 贺红星，张永茂，史久英，等.高产低色素普鲁兰生产菌株的复合筛选［J］.食品工业科技，2008，29（9）：145－148.

［6］ 朱永强，方尚玲，覃敬羽，等.短梗霉多糖菌的复合诱变筛选及培养基优化［J］.食品与发酵科技，2010，46（1）：47－51.

［7］ 于航，童群义.培养基对短梗霉多糖产量及其发酵液颜色的影响［J］.食品科技，2007，32（4）：24－26.

［8］ 于航，童群义.低色素出芽短梗霉G－58发酵的初步研究［J］.食品研究与开发，2006，17（11）：65－68.

［9］ 潘素娟，王建军，焦成谨，等.低色素出芽短梗霉 W2003发酵条件研究［J］.天水师范学院学报，2010，30（2）：59－62.

［10］ Slonimski P P，Perrodin G，Croft J H.Ethidium bromide induced mutation of yeast mitochondria：Compelete transformation of cells into respiratory deficient non－chromosomal"Petites"［J］.Biochemical and Biophysical Research Communication，1968，30（3）：232－239.

［11］ Kelly P J，Catley B J.The effect of ethidium bromide mutagenesis on dimorphism，extracelluler metabolism and cytochrome levels inAureobasidium pullulans［J］.Journal of Genreral Microbiology，1977，102（2）：249－254.

［12］ 邓长江，李长清，朱希强，等.产普鲁兰糖出芽短梗霉菌株的初步筛选［J］.食品与药品，2007，9（2A）：18－20.

［13］ Dominguez J B，Goi F M，Uruburu F.The transition from yeastlike to chlamydospore cells inPullularia pullulans［J］.Journal of General Microbiology，1978，108（1）：111－117.

［14］ Heald P J，Kristiansen B.Synthesis of polysaccharide by yeastlike forms ofAureobasidium pullulans［J］.Biotechnology and Bioengineering，1985，27（10）：1516－1519.

Ethidium Bromide Induced Mutation ofAureobasidium Pullulans

HU Hong－sen，YE Bin
（Department of Biotechnology，Wuhan Biotechnology Institute，Wuhan430415，China）

Aureobasidium pullulanswas mutagenized by ethidium bromide，and a pigment－free mutant BM2－5 was obtained，for which the cells were of yeast－like form in liquid fermentation.When BM2－5 was cultured at 27℃and 200 r·min－1for 72 h in the liquid culture medium with enzymatic hydrolyzed rice glucose as carbon source，the maximum pullulan polysaccharide production was 68.06 g·L－1.

Aureobasidium pullulans；mutagenesis；ethidium bromide；pullulan

TS 261.1

A

1672－5425（2012）11－0061－03

10.3969／j.issn.1672－5425.2012.11.017

2012－08－06

胡洪森（1966－），男，湖北鄂州人，高级工程师，研究方向：食品发酵技术，E－mail：huhsm＠163.com。