脑栓通胶囊对痴呆小鼠脑组织MAO及海马神经元的影响

卢旱云 吴 铁 郑志明

广东医学院药理教研室，广东湛江 524023

脑栓通胶囊对痴呆小鼠脑组织MAO及海马神经元的影响

卢旱云△吴 铁▲郑志明

广东医学院药理教研室，广东湛江 524023

目的 研究脑栓通胶囊对D-半乳糖所致痴呆小鼠脑组织MAO及海马神经元的影响。 方法 将36只小鼠随机均分为正常对照组、模型组、脑栓通胶囊组和脑复康阳性对照组。模型组、脑栓通胶囊组和脑复康阳性对照组每天皮下注射D-半乳糖120 mg/kg，连续注射6周；正常对照组每天皮下注射同等体积的生理盐水；模型对照组与正常对照组每天灌胃等量的生理盐水，脑栓通胶囊组灌胃量1.35粒/（kg·d），脑复康组灌胃量0.36 g/（kg·d）。实验结束后，测定脑组织MAO活性及光镜下观察小鼠大脑海马形态学改变。 结果 模型组小鼠脑组织MAO活性升高，海马区出现病理形态学改变，经脑栓通胶囊治疗后小鼠脑组织MAO活性降低，形态学病理改变减轻，与正常对照组比较差异无统计学意义。结论 初步表明脑栓通胶囊能降低MAO活性，保护海马神经元，可用于预防和治疗MAO活性增高导致的相关疾病。

D-半乳糖；脑栓通胶囊；小鼠；MAO；海马神经元

脑栓通胶囊是活血化瘀复方中药，由蒲黄、赤芍、郁金、天麻、漏芦组成。具有降血脂、抗动脉粥样硬化、降低血压、降低血黏度、抑制血小板凝集、抗血栓形成、增加脑血流量、抗自由基脂质过氧化、减少缺血性脑梗死的梗塞面积等药理作用[1]。临床常用于风痰瘀血痹阻脉络引起的缺血性中风中经络急性期和恢复期；但对老年性痴呆是否有预防和治疗作用，目前还没有文献报道。基于脑栓通胶囊具有抗自由基脂质过氧化、清除自由基、保护脑等作用，本研究采用D-半乳糖建立老年性痴呆动物模型，观察脑栓通胶囊对D-半乳糖所致痴呆模型小鼠脑组织MAO及海马神经元的影响，观察其是否具有抗老年痴呆的作用，为脑栓通胶囊用于老年性痴呆的预防及治疗提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明小鼠36只，雌雄各半，体重 18～22 g，由广州穗北实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2002-0003。动物适应性饲养1周后，开始正式实验。

1.2 药品与试剂

脑栓通胶囊（广东华南药业集团有限公司，Z20040093）0.4 g/粒。由蒲黄、赤芍、郁金、天麻、漏芦五味中药组成。吡拉西坦片（脑复康，广东华南药业集团有限公司，H44020779）。 D-半乳糖（Amresco公司，20100105349），MAO试剂盒（南京建成生物工程研究所），HE染液试剂盒（南京建成生物工程研究所），其他试剂为市售分析纯（天津市大茂化学试剂厂）。

1.3 仪器

Leica石蜡切片机（leica公司，Leica2155）；显微镜（Nikon eclipse 80i，Japan）；JJ500型电子分析天平（MC，江苏常熟市双杰测试仪器厂）；酶标仪（Biotek，USA）；离心机（eppendorf，centrifuge 5810 R）；漩涡混合器（Maxi mixⅡ，Barnstead/Thermolyne）。

1.4 方法

将36只小鼠随机均分为正常对照组（n=10）、模型组（n=10）、脑栓通胶囊组（n=10）和阳性对照脑复康组（n=6）。模型组、脑栓通胶囊组、脑复康组每天给予皮下注射D-半乳糖120 mg/kg，连续注射6周，每周称重1次。正常对照组每天皮下注射同等体积的生理盐水。模型对照组与正常对照组每天灌胃生理盐水，脑栓通胶囊组每天灌胃1.35粒/（kg·d），脑复康组灌胃量0.36 g/（kg·d）。于造模给药第42天，眼球取血处死动物。在4℃冰浴条件下迅速取脑，去除嗅球、小脑及脑干，生理盐水清洗后滤纸吸干于电子分析天平称重，记录脑总重量。分开左右脑，右脑放置于密封袋中置冰箱中保存待测生化指标，左脑泡10%中性福尔马林固定待脑切片观察海马神经元形态改变。称右脑加9倍冰生理盐水制成10%脑匀浆备用，并按照南京建成生物工程研究所MAO试剂盒说明用酶标仪测定脑组织的MAO活性。4 d后取左脑常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，冠状切片，片厚5μm，制好片于60℃烘烤1 h后HE染色。染色后通过显微镜选取海马CA1、CA2、CA3及齿状回各区进行形态学观察。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 脑栓通胶囊对小鼠体重的影响

正常组前2周体重轻度下降，第3周开始体重有所回升并趋于平衡。模型组前3周体重下降较明显，第4周开始体重有所回升但不明显，整个给药期间这一组的体重都比其他组轻。脑栓通胶囊组前2周体重上升，第3周开始至第5周体重下降得较明显，其间与模型组比较体重有增加的趋势，第6周开始体重有所回升。脑复康组体重变化不大，整个实验过程在1 g范围内波动。见表1、图1。

图1 脑栓通胶囊对小鼠体重的影响

2.2 脑栓通胶囊对小鼠脑总重量和MAO活性的影响

模型组脑重减轻，脑组织MAO活性升高，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；经脑栓通胶囊治疗后脑重增加，MAO活性下降，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；脑复康组脑重与正常组、模型组比较未见显著差异，但脑组织MAO活性升高，与正常组、模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 脑栓通胶囊对小鼠脑总重量和MAO活性的影响（± s）

表2 脑栓通胶囊对小鼠脑总重量和MAO活性的影响（± s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

MAO[U/（h·mgprot）]正常组 10 - 0.300±0.020 2.83±1.88模型组 10 - 0.280±0.017* 6.90±4.86*脑栓通胶囊组 10 1.35粒/（kg·d） 0.297±0.016△ 3.01±1.02△脑复康组 6 0.36 g/（kg·d） 0.290±0.018 17.24±2.31**△△组别 n 剂量 脑组织的总重量（g）

2.3 脑栓通胶囊对痴呆小鼠脑组织海马各区的影响

2.3.1 低倍镜下脑栓通胶囊对实验小鼠脑组织海马各区的影响 低倍镜观察发现，正常对照组海马结构完整，神经细胞排列紧密，层次清楚、结构清晰，CA3区有少量神经细胞核深染（2-A、3-A）；模型组大鼠海马神经细胞数目减少，层次减少，尤其CA1区排列较正常组疏松，且CA1、CA2、CA3 和齿状回各区均见大量神经元细胞核深染，与空白对照组相比有显著差异（2-B、3-B）；脑栓通胶囊组大鼠海马神经细胞数目较模型组有所增加，层次较清，亦见CA3区有少量神经细胞核深染，与空白对照组相比没有明显差异（2-C、3-C）；脑复康组大鼠海马神经细胞数目同样较模型组有所增加，层次较清，亦见CA3区有少量神经细胞核深染，与空白对照组相比没有显著差异（2-D、3-D）。见图 2～ 3。

2.3.2 高倍镜下脑栓通胶囊对实验小鼠脑组织海马CA1、CA2、CA3及齿状回各区的影响 高倍镜下（4-A、5-A、6-A）正常对照组CA1、CA2、CA3神经元细胞体大、丰满、圆润，胞浆丰富,细胞核清晰,细胞间排列整齐,界限清楚，齿状回（DG）可见少量变性细胞核深染；模型组与正常对照组比较CA1、CA2、CA3及齿状回神经元数目明显减少,可见大量的神经元细胞核固缩、坏死、深染，细胞间排列疏松，界限模糊，偶见小胶质细胞吞噬现象（4-B、5-B、6-B）；脑栓通胶囊组海马各区与正常对照组比较未见显著差异，神经元数目较多,细胞体大、丰满、圆润、形态规则,细胞核清晰，偶见少量变性细胞散在其间，细胞间排列较整齐，界限较清楚（4-C、5-C、6-C）；脑复康组海马各区与正常对照组比较亦未见显著差异（4-D、5-D、6-D）。见图4～6。

表1 脑栓通胶囊对小鼠体重的影响（± s，g）

表1 脑栓通胶囊对小鼠体重的影响（± s，g）

注：与模型组比较，△P＜0.05

组别 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周 第6周正常组 29.43±3.63 28.46±2.57 29.24±3.12 29.5±3.13 29.69±3.14 29.69±3.29模型组 28.5±2.59 27.52±3.17 27.03±3.62 27.39±2.95 27.76±2.66 28.15±2.39脑栓通胶囊组 30.99±4.24 31.46±4.11△ 30.64±4.31△ 30.04±3.69 29.49±3.57 30.58±3.06脑复康组 31.09±3.77 30.51±3.65 30.03±3.74 30.17±3.51 30.72±4.07 29.51±4.33

图2 痴呆小鼠低倍镜下形态图（HE×40）

图3 痴呆小鼠低倍镜下形态图（HE×100）

图4 痴呆小鼠CA1区神经细胞图（HE×400）

图5 痴呆小鼠CA2-CA3区神经细胞图（HE×400）

图6 痴呆小鼠齿状回神经细胞图（HE×200）

3 讨论

本研究发现，给小鼠皮下注射D-半乳糖（120 mg/kg），连续注射6周，小鼠脑组织出现海马神经元的病理改变及MAO活性升高。实验中笔者通过HE染色后光镜下不同倍数观察了海马CA1、CA2、CA3及齿状回各区的神经形态变化，发现模型组海马CA1、CA2、CA3及齿状回神经元损伤严重，表现为HE染色后神经细胞核深染，固缩、坏死，核膜界限不清，CA1偶见小胶质细胞吞噬现象，与正常组比较有显著差异；脑组织生化检测发现MAO活性升高。Folstein M等[2]研究证明海马与学习记忆密切相关，而学习记忆障碍是脑老化的一种重要表现。因此，海马成为脑衰老研究的重要指标。MAO是大脑周围神经组织中一种十分重要的酶，不仅能提高有害的H2O2的水平，而且可以使单胺类神经递质含量下降，促进神经系统的老化过程[3]。王鹏琴等[4]研究显示，AD患者脑组织中MAO活性升高，氧化分解单胺类神经递质，影响学习及注意力。而衰老是一个复杂的过程，受许多生理病理因素的影响。其中“衰老的自由基理论”是目前比较公认的学说[5]。Pauwels EK、Rossi L等[6-7]研究表明，氧自由基引起的损伤所导致的细胞功能紊乱在其中起着重要作用，而脑组织耗氧量较大及其含有单胺氧化酶等特性，导致氧自由基引起的损伤在脑组织更为明显。本研究中，模型脑组织MAO活性升高，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05），代表模型的复制已造成与AD相关的氧化损伤。

经脑栓通胶囊治疗后，小鼠脑组织海马神经的病理改变得到改善，神经元数目较多，细胞形态规则，细胞核清晰，偶见少量变性细胞散在其间，细胞间排列较整齐，界限较清楚；脑组织生化检测发现痴呆小鼠MAO活性降低，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 据现代药理研究和长期临床观察表明，脑栓通胶囊具有降血脂、抗动脉粥样硬化、降低血压、降低血黏度、抑制血小板凝集、抗血栓形成、增加脑血流量、抗自由基脂质过氧化、减少缺血性脑梗死的梗死面积等药理作用[1]，通常用于风痰瘀血痹阻脉络引起的缺血性中风中经络急性期和恢复期；症见半身不遂，口舌歪斜，脉沉细或弦细，弦没；脑梗死上见述表现者。目前西医对老年痴呆的治疗仍无令人满意的药物，虽然有些药物有一定效果，但疗程长、费用高，给患者家庭及社会带来了沉重的经济负担。因此，有针对性地开发研制切实有效的防治药物已迫在眉睫。查文献脑栓通胶囊用于治疗老年痴呆未曾报道，基于脑栓通胶囊具有抗自由基脂质过氧化，清除自由基、保护脑等作用，笔者观察了脑栓通胶囊对D-半乳糖所致衰老模型小鼠脑组织MAO及海马神经元的影响，发现其具有降低痴呆小鼠脑组织MAO活性和改善痴呆小鼠脑组织病理改变的作用，这一发现在原有药物的基础上发现其新用途，为脑栓通胶囊用于痴呆治疗提供了实验依据。初步表明中药脑栓通胶囊能通过提高脑组织抗氧化性和清除自由基的能力来改善痴呆小鼠脑组织的形态病理改变。

经脑复康治疗后，小鼠脑组织海马各区与正常对照组、脑栓通胶囊组比较未见显著差异，神经元数目较多，细胞形态规则，细胞核清晰，偶见少量变性细胞散在其间，细胞间排列较整齐，界限较清楚。但脑组织MAO活性升高，原因有待进一步探讨。

4 结论

本研究证明了给小鼠连续皮下注射6周D-半乳糖可致小鼠脑组织MAO活性升高，海马神经出现病理改变，脑栓通胶囊对D-半乳糖导致的痴呆小鼠脑组织的这种改变有一定的对抗作用，提示脑栓通胶囊可作为单胺氧化酶的抑制剂，用于预防和治疗脑组织单胺氧化酶过高的疾病。

[1]李仪奎，姜名瑛.中药药理学[M].北京：中国中医学出版社，1992：198.

[2] Folstein M，Folstein S.Functional expressions of the aging brain[J].NutrRev，2010，68（Suppl 2）：S70-73.

[3] 殷莹，田清涞.单胺氧化酶及其抑制剂与老年神经变性疾病[J].中国老年学杂志，1998，12（3）：122.

[4] 王鹏琴，王丽波，曹凤武.眼针疗法对血管性痴呆大鼠学习记忆障碍及海马组织乙酰胆碱酯酶活性的影响[J].中医药学刊，2004，22（4）：731.

[5] Harman D.Aging：a theory based on free radical and radiation chemistry[J].J Gerontol，1957（2）：298-300.

[6] Pauwels EK，Erba PA，Kostkiewicz M.Antioxidants：a tale of two stories[J].Drug News Perspect，2007，20（9）：579-585.

[7] Rossi L，Mazzitelli S，Arciello M，et al.Benefits from dietary polyphenols for brain aging and Alzheimer's disease[J].Neurochem Res，2008，33（12）：2390-2400.

The influence of naoshuantong capsule on MAO and hippocampal neuron in aging model mice's brain

LU Hanyun WU Tie ZHENG Zhiming
Department of Pharmacology,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023,China

ObjectiveTo observe the influence of naoshuantong capsule on MAO and hippocampal neuron in ageing model mice's brain induced by D-galactose.Methods36 mice were randomly divided into 4 groups:blank group,model group,naoshuantong capsule group and piracetam positive control group.The mice in blank group were subcutaneous injected with the same volume of saline,The others group were administrated with D-galactose 120 mg/(kg·d)for successive 6 weeks.Simultaneous,mice in blank and model groups were daily administrated with the same dose of saline while the naoshuantong capsule group was administrated with 1.35 pellet/(kg·d) and the piracetam positive control group was fed with 0.36 g/(kg·d) .After 42 days,the mice were killed and taken the brain.The activity of MAO in hippocampus of mices were detected and hippocampal neuronal structures were observed by light microscope.ResultsThe content of MAO increased and appeared pathological morphology change in the hippocampal structures in the model group.After treated with naoshuantong capsule the content of MAO was reduced and the morphological pathological change was alleviated.Compared with the blank group,there was no significant difference.ConclusionIt preliminarily indicates that naoshuantong capsule can reduce MAO activity,protect hippocampal neuron and can be used for the prevention and treatment in related diseases induced by MAO increased.

D-galactose;Naoshuantong capsule;Mice;MAO;Hippocampal neuron

R-332

A

2095-0616（2012）11-30-04

广东省科技计划项目（2010B060500014）。△广东医学院药理学2011级在读硕士研究生

▲通讯作者

2012-05-04）