香菇多糖 Lentinan的提取分离、生物活性和构效关系的研究进展

徐晓飞，闫慧丹，罗 珍，张学武

（1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640；2.无限极（中国）有限公司，广东广州510665）

香菇多糖 Lentinan的提取分离、生物活性和构效关系的研究进展

徐晓飞1，2，闫慧丹1，罗 珍2，张学武1

（1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640；2.无限极（中国）有限公司，广东广州510665）

香菇多糖Lentinan是从香菇中分离出来的具有重要生物活性的物质，文章系统地阐述了近年来有关香菇多糖Lentinan的提取分离纯化方法、生物活性、结构与活性关系等方面的研究进展，并展望了今后香菇多糖Lentian的研究方向。

香菇多糖，生物活性，结构和功能

1.1 香菇多糖Lentinan的提取方法

多糖提取方法主要根据分离目标在生物组织中的结构和位置来选择。水溶法和碱溶法是多糖提取分离中最常用的方法。香菇多糖Lentinan是香菇子实体细胞壁的结构成分。Chihara运用热水提取、CTAB沉淀分离并进一步分离纯化获得香菇多糖Lentinan，该方法提取率低且耗时长[1-2]。随后Yap和Ng对Lentinan的提取方法进行了改进，对样品采用均质和液氮冷冻等处理，在同一实验室环境条件下Lentinan提取得率比前者方法提高了约80倍，比常规普通的水提醇沉分离提高了约10倍，但多糖纯度有所下降且含杂质较多[11-12]。武汉大学张俐娜实验团队通过用1.25mol/L NaOH/0.05%NaBH4溶液来提取香菇子实体中的Lentinan，经提取液中和、脱蛋白等工艺后Lentinan的提取得率可达到5%[12]，具体方法获得的Lentinan对比信息见表1。

在提取参数中，温度是影响多糖提取的主要因素，另外料液比、浸提时间也均影响提取率[15]。增加对样品的处理如脱脂以及碱液作用破坏氢键可明显提高香菇多糖的提取得率[16]。此外，增加一些生物或物理的辅助手段，对香菇多糖得率提高也有帮助，有人采用复合酶与热水浸提相结合的方法提取香菇多糖，复合酶由果胶酶、纤维素酶及中性蛋白酶组成，该法条件温和、杂质易除、得率高。在降低蛋白质含量、提高多糖提取率及改善糖类分布等方面有很好的效果[17]；刘晓丽[18]利用微波辅助法提取香菇多糖，香菇多糖提取率可达9.46%。此外，还有一些其它提取方法，如亚临界水技术提取方法，在最佳条件下，香菇多糖得率可达15.7%，明显降低提取时间和提高香菇多糖得率[19]。必须说明的是，国内研究者使用的这些提取方法是用香菇总多糖的得率来评价工艺效率，不能反映Lentinan的得率情况。

表1 Lentinan不同提取方法的信息比较Table 1 Information of different extracting methods of Lentinan

1.2 香菇多糖的分离纯化

多糖的纯化是将分离所得的混合多糖纯化为各种单一的多糖。常用的纯化方法有：分级沉淀法、柱层析法、离子交换法、超滤法、制备性区域电泳法等。实质上，分离与纯化是很难明显区别开来的，因为有时在分离过程已经包括纯化（譬如先用中性热水提取，再用碱性水提取，即将中性水溶多糖及酸性水溶多糖按溶解度不同分离开来）。相反，有的在纯化过程中进一步得到分离。由于多糖是生物大分子，多糖的纯度不能用通常小分子化合物的纯度标准进行衡量，因为多糖纯品在微观结构上也不是完全一致的，通常所说的多糖纯品实际上是一定分子量范围内的均一组分。

最初使用季胺盐有十六烷基三甲基胺盐的溴化物（CTAB）及其碱（CTAB-OH）用于分离纯化香菇多糖Lentinan[1-2]。近来柱层析法是应用最多的一种纯化多糖的方法。常分为两类：一类是具有分子筛作用的凝胶柱层析，常用的凝胶有葡萄糖凝胶、琼脂糖凝胶等，洗脱剂是不同浓度的盐和缓冲液；另一类是离子交换层析，常用的交换剂有DEAE-纤维素、DEAE-葡萄糖、DEAE-琼脂糖等。李珺等[20]利用DEAESepharose Fast Flow将香菇多糖粗制品柱层析，得到5种香菇多糖，并经Sephadex-G2200检测其为纯多糖。层析法是一套高效快速的香菇多糖纯化方法，从香菇浓缩液中纯化的多糖含量可达95.55%[21]。此外，一些新技术如超滤和制备色谱也应用于多糖分离纯化中。超滤技术是一种膜过滤技术，利用膜的选择性，由于膜两侧存在的能量差而造成溶液中各组分通过膜的迁移速度的不同，从而实现分离。谢红旗等[22]采用截留分子量为50ku和300ku的两种陶瓷膜，将预处理过的香菇料液分成三种不同分子量范围的多糖，但是所分离得到的组分还是一种混合物。由于香菇多糖Lentinan分离纯化工艺复杂、收率低、成本高，因此要得到纯度比较高的香菇多糖Lentinan，开发高效的分离纯化技术刻不容缓。高速逆流色谱（HSCCC）技术具有处理量大、适应性强、产品损失小，能一次制备性地分离复杂的样品等优点，可从粗制样品中制备高纯度的化合物，已有学者用它进行分离纯化香菇多糖的尝试[23]。

2 香菇多糖Lentinan的结构

多糖结构层次可以分为一、二、三、四级，一级结构主要体现在单糖残基的组成、排列顺序、连接方式等；二级结构是指多糖的主链间以氢键结合的各种聚合体，关系到多糖分子中主链的构象，但不涉及侧链的空间排布；在二级结构的基础上，糖单位间的非共价键相互作用形成有规则而粗大的构象和聚合体即多糖的三、四级结构[24]。香菇多糖由于组成结构复杂，主要是通过分子量、单糖组成及摩尔比测定、糖苷键构型及构象分析等来表征。

2.1 香菇多糖Lentinan的一级结构

香菇多糖的一级结构主要包括单糖组分，单糖的连接点类型，单糖和糖苷键的构型和重复单元。通过甲基化分析，Smith降解和酶解等方法可以获得[25-26]单糖的链接方式及次序，糖苷键的位置，重复单元等信息。糖苷键构型（α或β）和常规官能团分析一般采用核磁共振光谱（NMR）和红外光谱（IR）等方法。Sasaki和Takasuka通过甲基化、Smith降截等方法确认Lentinan主链为β-D-（1→3）-连接糖苷键，侧链为β-（1→6）-葡萄糖残基，并进一步得出该多糖的一级结构具有β→D→（1→3）连接的吡喃葡聚糖主链，在主链中葡聚糖的C6位上有支链点（每五个D-葡萄糖有两个支点）[27]（图1）。其分子量用光散射法测定为9.5×105～10.5×105Du[28]，GPC法测定范围是3×105～8×105Du[29]。同样研究方法也适用于其他来源分离得到的香菇多糖。Umberto[30]等将从发酵香菇菌丝体中得到的香菇多糖进行一维及二维NMR分析，确定其中一种是具有β-D-（1→3）连接的吡喃葡聚糖主链的葡聚糖。卢成英等[31]通过红外光谱分析所获香菇多糖糖苷键构型，表明了β-吡喃糖基的存在，说明其分离纯化所得香菇多糖为β-吡喃多糖。

图1 香菇多糖（Lentinan）的重复单元结构[33]Fig.1 Repeat units of Lentinan

一般分离方法的不同，所得多糖的结构也有所不同，从子实体和发酵培养的菌丝体中分离的香菇多糖分子结构也有一定的差异。但已明确结构与免疫活性关系的只有香菇子实体中提取分离得到的β-葡聚糖Lentinan。另外，香菇中的多糖物质还有D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-木糖等，也有来源于深层发酵香菇菌丝体中的α-甘露糖苷[32]。

2.2 香菇多糖Lentinan的高级结构

多糖的高级结构与多糖的生物活性密切相关，明确香菇多糖的高级结构具有重要意义。天然香菇多糖Lentinan具有β-三股绳状螺旋型立体结构，但加入尿素或二甲亚砜转变为单股螺旋结构[34]（如图2所示）。

图2 香菇多糖Lentinan的三螺旋和单链结构示意图Fig.2 Schematic of helix chain and single chain conformation of Lentinan

香菇多糖Lentinan的链构象在不同的溶液中存在的形式不同，例如无规卷曲状、单股螺旋、双螺旋、三股螺旋、球状聚合体等。在保持多糖有规则的立体构象中，氢键起着重要的作用，在水中维持香菇多糖三螺旋结构的主要作用力是分子间的氢键[35]。破坏分子间和分子内的氢键会引起香菇多糖立体构象的变化。香菇多糖Lentinan构象变化与溶剂、温度、pH相关。

香菇多糖Lentinan可溶于水和二甲基亚砜（DMSO）中，在水中是三螺旋构象，在DMSO中转变为单股螺旋构象（如图2）。在水和DMSO的混合液中，水的比重逐渐降低到0.15左右时，香菇多糖由三螺旋构象转变成单链构象，而且这种转变是不可逆转的[36]。对香菇多糖进行热处理，会发生类似的构象转变，Wang等[33]的实验证明，温度在130~145℃时，香菇多糖Lentinan构象会由三螺旋转变成单线圈，同样这种转变也是不可逆转的。此外，随着Lentinan溶液pH的不同，Lentinan的构象也会发生变化，NaOH浓度小于0.05mol/L时，Lentinan呈三螺旋构象；在0.05~0.08mol/L的范围内，溶液中多糖构象三螺旋与单链共存；大于0.08mol/L时，Lentinan会全部转变为单链形式存在[38]。在再生纤维素透析袋中15℃下透析7d后，这些多糖会重新恢复其三螺旋结构[38]。

3 香菇多糖Lentinan的生物活性

香菇多糖具有多种生物学功能，许多学者对香菇多糖Lentinan的活性进行了相关的研究，总结其主要生物学活性如表2。

4 香菇多糖Lentinan的结构与功能的关系

香菇多糖具有多种生物功能，而它的化学结构是其生物活性的基础。一些学者认为多糖的抗肿瘤活性可能与其β-（1→3）主链的螺旋结构有关，即三股螺旋结构或一股螺旋结构[48]。另一些研究认为从香菇多糖（Lentinan）酸解分离获得的寡糖片段只有分子量大于16000才有抗肿瘤活性[49]。一般而言，香菇多糖Lentinan的生物活性主要与分子中的单糖组成、糖苷键的构型、取代基和高级结构有关。

4.1 香菇多糖lentinan单糖组成、糖苷键与活性的关系

通过多元回归分析法研究香菇中多糖的单糖组成及摩尔比对其生物活性的影响，结果表明：树胶醛醣、木糖、甘露糖和半乳糖以及其摩尔比与多糖刺激巨噬细胞的生物活性有着密切的关系，而葡萄糖尽管是组成香菇多糖结构的重要部分，但对其生物活性的影响较小[50]。有人推测含有葡萄糖和甘露糖的多糖具有抗肿瘤的活性是因为巨噬细胞中有一个或多个多糖受体，这些受体对葡萄糖和甘露糖具有专一性[51]。不同种类的多糖，其主链糖基组成和糖苷键类型不同，生物学活性存在较大差异。香菇多糖Lentinan中以β-（1→3）葡聚糖为主链结构，已被证实具有抗肿瘤和免疫调节的功效[1-2]。利用化学方法合成出的四种与Lentinan相似的寡糖，β-（1，6）-分支β-（1→3）-葡聚六糖和包含α-（1，3）-连接的β-（1→3）-葡聚六糖相似物也具有增强免疫活性和病毒相关的CTL活性[52-54]，由此暗示糖苷键组成对Lentinan的活性有一定的影响，而单糖组成影响较小。

4.2 香菇多糖Lentinan取代基团与活性的关系

表2 香菇多糖Lentinan的主要生物活性Table 2 Main bioactivities of Lentinan

研究发现，多糖的活性与其中是否有某些化学基团有关，而这些化学基团可以通过人为的化学反应来添加和消除，以达到提高多糖活性和研究多糖构效关系的目的。例如硫酸根对抗HIV病毒是必须的，并且其抑制HIV的作用同分子中硫酸盐含量有关。含量愈高，其抗HIV的作用愈强[55]。糖链上引进硫酸化集团的过程中，多糖分子间、分子内用来维持三螺旋构象的氢键被破坏，而多糖的溶解性和糖链的刚性增强了。而硫酸化的香菇多糖抗肿瘤活性低于三螺旋的多糖，高于单链多糖，这说明和硫酸基团相比，香菇多糖的三螺旋结构对其生物活性的影响更大[56]。

4.3 香菇多糖Lentinan高级结构与活性的关系

对多糖生物活性与化学结构关系的深入研究发现，二者不仅是建立在多糖分子一级结构基础上，而且还与多糖分子的高级结构即空间构象有密切关系。研究结果表明：高分子量的β-（1→3）-D-葡萄糖的高度有序结构（三股螺旋）对于免疫调节活性至关重要。多糖的高级结构与其生物活性的关系至今还不十分清楚，但二级或三级结构在活性方面起更大的决定作用的观点则得到一致公认[57]。香菇多糖三螺旋结构是其具有生物活性的重要结构特征，β-（1→3）-D-葡聚糖具有的多种生物活性都与它的三螺旋结构紧密相关。在香菇多糖中加入尿素或二甲基亚砜，使分子的立体构型发生改变，即破坏其三螺旋构象，则其抗肿瘤活性就会降低甚至丧失[4]。然而香菇多糖三螺旋结构具体是怎样影响它的生物活性的至今尚不清楚，很多生物活性，例如巨噬细胞合成NO和免疫因子的激活都要依赖三螺旋构象；然而，还有一些活性，例如干扰素和克隆刺激因子的合成则与三螺旋结构不相关[58]。

5 展望

Lentinan具有多种生理活性，在医药保健行业具有广泛的用途和前景。然而Lentinan要应用于临床，特别是作为注射用药物，必须有足够的纯度，所以改善香菇多糖的分离提纯技术，开发出一条合理、经济的制备高纯度香菇多糖的新工艺，具有良好的应用价值。在保健食品行业，虽然对Lentinan的纯度要求不高，但是目前现有的提取工艺得率较低，最高仅为5%且耗时长，而香菇子实体细胞壁中绝大部分为β-（1→3）-D葡聚糖结构物质，含量接近65%[59]，存在足够的提取得率提升空间，因此开发高效提取工艺，对于降低Lentinan生产成本具有重要的实际意义。此外，虽然香菇多糖Lentinan对一些疾病有很好的作用效果，但缺乏对其结构、构效关系和作用机理的完整认识，且不同提取方法得到的Lentinan在结构上存在一定的差异，是否影响作用效果以及作用机理是否一致还难以证明。目前的研究成果还不足以描述清楚Lentinan在体内发生作用的机理，这在一定程度上影响了其在临床上的应用，因此香菇多糖Lentinan准确的结构分析以及对应的作用机理研究也是今后研究的重要方向。

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Research progress in exaction and purification methods，bio-activities，relationship between structure and function of Lentinan

XU Xiao-fei1，2，YAN Hui-dan1，LUO Zhen2，ZHANG Xue-wu1
（1.College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.Infinitus（China）Company LTD.，Guangzhou 510665，China）

Lentinan isolated from the fruit body of Lentinula edodes is a kind of substance with important biological activities.Current studies of the Lentinan isolated from the fruit body of Lentinula edodes，including methods of extraction and purification，biological activities，the relationship between structure and function，and the future research direction were summarized.

Lentinan；bio-activities；structure and function

TS201.2

A

1002-0306（2012）07-0435-06

香菇（Lentinula edodes）为担子菌纲伞形科真菌，是食用兼药用菌之一。1969年Chihara等首次用热水从香菇子实体中提取纯化出具有抗肿瘤作用的多糖类物质，进一步纯化后得到由葡萄糖组成的均一组分，进一步确认具有明显的抗肿瘤作用，将其命名为Lentinan[1-2]，此后，大量工作证明香菇多糖Lentinan具有抗肿瘤、调节免疫、抗病毒、抗过敏、抗炎等功能[2-6]。临床应用中证明，香菇多糖联合化疗可有效减轻癌症患者化疗不良反应，提高患者的免疫功能，提高患者的生活质量和延长存活时间[7-10]。随后人们在香菇多糖Lentinan的提取分离、生物活性、结构与功能的关系等方面做了大量的研究。本文从提取分离、生物活性和构效关系对香菇多糖Lentinan的研究进行综述，为相关的研究者提供参考。

1 香菇多糖Lentinan的提取分离

多糖的提取分离纯化是多糖研究的关键，其成功与否、效果的好坏都会直接影响后续研究的可行性与结果的可信度。

2011－04－18

徐晓飞（1979－），男，博士研究生，中级工程师，研究方向：功能性多糖保健品开发。