超滤大豆蛋白肽对小鼠免疫功能的影响

富校轶，李博群，张时莹，姚 磊

（国家大豆工程技术研究中心东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030）

超滤大豆蛋白肽对小鼠免疫功能的影响

富校轶，李博群，张时莹，姚 磊*

（国家大豆工程技术研究中心东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030）

目的：研究超滤大豆蛋白肽对小鼠免疫功能的影响。方法：以正常小鼠为实验对象，观察不同剂量（0.85g/kg·bw、1.7g/kg·bw、5.1g/kg·bw）的超滤大豆蛋白肽对小鼠脾脏指数、胸腺指数、小鼠迟发型变态反应（足跖增厚法）、半数溶血值和碳粒廓清指数的影响。结果：与对照组（30.25±2.12）相比，高剂量组和中剂量组的超滤大豆蛋白肽半数溶血值水平[（51.08±8.33），（38.29±5.51）]显著提高[（p<0.01），（p<0.05）]；与对照组（4.90±0.63）相比，高剂量组和中剂量组超滤大豆蛋白肽吞噬指数[（5.78±0.69），（5.62±0.57）]显著提高（p<0.05）；但各剂量组动物的脾脏指数、胸腺指数以及足趾厚度差无显著性差异（p>0.05）。结论：超滤大豆蛋白肽具有增强免疫功能中体液免疫功能和单核-巨噬细胞吞噬功能的作用。

超滤大豆蛋白肽，免疫调节作用，半数溶血值，迟发型变态反应

超滤大豆蛋白肽是一种大豆蛋白酶改性后又经超滤膜分离富集后的大豆肽[1]。大豆肽是由3~6个氨基酸组成的低分子量肽。大豆肽的蛋白质含量为85%左右[2]。大豆肽具有易消化吸收、能迅速供给机体能量、无蛋白变性、无豆腥味、液体粘性小和受热不凝固等特性，在粘度、渗透压、乳化性、溶解性等理化特性方面有优势[3]，大豆肽已成为大豆蛋白深加工的一个重要方向。近年来，研究表明，大豆肽有多种生物活性[4]如降低血清胆固醇、降血压、增加免疫和促进脂肪代谢等，其中，大豆肽在免疫活性方面的活性引起了关注。大豆肽能提高机体免疫力和抗病力，大豆肽对免疫反应具有潜在的刺激作用[5]。但是目前的研究所采用的大豆肽样品各异，未见超滤大豆蛋白肽的研究报道，并且，目前的报道都只是对免疫功能中细胞免疫、体液免疫以及非特异性免疫的某一项或二项进行研究。本实验系统地考察了超滤大豆蛋白肽对小鼠免疫功能的影响，以期为超滤大豆蛋白肽的开发提供理论和实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

昆明种健康雌性小鼠100只 购于北京维通利华实验动物技术有限公司，在实验室喂养观察3d，使动物适应实验室环境。选择健康雌性小鼠96只，体重18～24g，随机分为8组，每组12只，随机选择4组52A8物作为免疫一组，余下的4组作为免疫二组。本次免疫的功能检测选择了全面反应细胞免疫、体液免疫以及非特异性免疫功能的4项实验，分别是迟发型变态反应实验、半数溶血值（HC50）测定实验、碳廓清实验以及动物脾脏和胸腺指数测定实验，其中前两个实验可以由同一批动物来完成，称为免疫一组；后两个实验由另一批动物共同完成，称为免疫二组；超滤大豆蛋白肽 大豆分离蛋白粉经复合蛋白酶水解（水解条件：温度45℃，底物浓度5%，酶用量10000IU/g，反应时间6h，反应pH为7），蛋白水解液3000r/min离心5min，取上清液采用膜分离方法截取分子量为1000到3000之间的复合肽经喷雾干燥成粉末，氮含量为14.3%；绵羊红细胞（SRBC）、补体（豚鼠血清） 哈尔滨市海峡贸易有限公司；印度墨汁 北京市西中化工厂。

游标卡尺（精密度0.01mm） 哈尔滨量具刃具厂；722-型分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；电子分析天平 梅勒特-托利多仪器（上海）有限公司；洁净工作台 哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.2 剂量设计

经查阅相关文献[6]，超滤大豆蛋白肽设三个剂量组，分别为0.85g/kg·bw（低剂量）、1.7g/kg·bw（中剂量）和5.1g/kg·bw（高剂量），同时设阴性对照组（蒸馏水）。各组动物按体重的2%灌胃容积进行灌胃，连续灌胃30d后测各项免疫指标。

1.3 实验方法

免疫一组动物进行迟发型变态反应（足跖增厚法）和半数溶血值测定的实验；免疫二组动物进行小鼠碳廓清实验以及脾脏指数和胸腺指数测定的实验。1.3.1 迟发型变态反应（足跖增厚法） 将免疫一组动物每只鼠经腹腔注射2%（V/V，用生理盐水配制）压积SRBC（2000r/min，10min）0.2mL，致敏后4d，用游标卡尺测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。然后在测量部位皮下注射20%（V/V，用生理盐水配制）压积SRBC 20μL，于注射后24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。以注射SRBC后24h的足跖厚度减去注射前SRBC足跖厚度的差值（足跖肿胀度）来表示小鼠迟发型变态反应的程度。

1.3.2 半数溶血值的测定 在上述迟发型变态反应结束的第2d，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释250倍，取1mL置试管内，依次加入10%（V/V，用SA缓冲液配制）压积SRBC 0.5mL，补体1mL（用SA缓冲液按1∶10稀释）。另设不加血清的对照管（以SA缓冲液代替），置37℃恒温水浴中保温30min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清液1mL、加都氏试剂3mL，同时取10%（V/V，用SA缓冲液配制）的压积SRBC 0.25mL、加都氏试剂至4mL于另一试管中，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。半数溶血值（HC50）按下式计算：

样品HC50＝样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数

1.3.3 小鼠碳廓清实验[7]小鼠按0.1mL/10g体重尾静脉注射1∶3.5倍稀释的印度墨汁，待墨汁注入，立即计时。

注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并将其加到2mL Na2CO3溶液中。用722型分光光度计在600nm波长处测光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白对照。按下式计算吞噬指数α：

注：α是吞噬指数；t1为2min；t2为10min；OD1为2min时的样品吸光度值；OD2为10min时的样品吸光度值。

1.3.4 脾脏指数和胸腺指数的测定 将小鼠称重后颈椎脱臼处死，取肝脏、脾脏和胸腺去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。按公式计算动物脾脏指数和胸腺指数。脾脏指数（%）＝脾脏重量/体重×100%胸腺指数（%）＝胸腺重量/体重×100%

1.4 数据处理及结果判定

将实验数据进行正态性和方差齐性的检验后，采用单因素方差分析方法（ANOVA）进行统计分析，判定标准P=0.05。经方差分析后，若各组均数不全相等，则用Dunnett-t进行各组之间的多重比较。

2 结果与分析

2.1 超滤大豆蛋白肽对小鼠体重的影响

给予超滤大豆蛋白肽30d后，小鼠体重的变化分别见表1和表2。

表1 超滤大豆蛋白肽对免疫一组小鼠体重的影响Table 1 Effect of ultrafiltration soybean peptide on mice body weight of the first immune group

表2 超滤大豆蛋白肽对免疫二组小鼠体重的影响Table 2 Effect of ultrafiltration soybean peptide on mice body weight of the second immune group

由表1和表2可知，与阴性对照组相比较，各免疫实验组动物的初始体重和终末体重均无显著性差异（p>0.05），说明本实验条件下超滤大豆蛋白肽对小鼠体重增长无影响。

2.2 超滤大豆蛋白肽对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响

小鼠给予超滤大豆蛋白肽30d后，对脾脏指数和胸腺指数的影响见表3。

表3 超滤大豆蛋白肽对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响Table 3 Effect of ultrafiltration soybean peptide on spleen index and thymus index

由表3可见，经口给予小鼠不同剂量的超滤大豆蛋白肽30d，与阴性对照组比较，各剂量组动物的脾脏指数和胸腺指数均无显著性差异（p>0.05）。说明超滤大豆蛋白肽对免疫器官脾脏和胸腺的总重量没有影响。

2.3 超滤大豆蛋白肽对小鼠迟发型变态反应（足跖增厚法）的影响

小鼠给予超滤大豆蛋白肽30d后对小鼠迟发型变态反应（足跖增厚法）的影响见表4。

表4 超滤大豆蛋白肽对小鼠迟发型变态反应（足跖增厚法）的影响Table 4 Effect of ultrafiltration soybean peptide on mice late onset allergy（foot palm thickening method）

由表4可见，与阴性对照组相比较，初始足跖厚度无显著性差异（p>0.05），经口给予小鼠不同剂量的超滤大豆蛋白肽30d，与阴性对照组相比较，各剂量组动物足趾厚度差无显著性差异（p>0.05），即超滤大豆蛋白肽不能够增强小鼠的迟发型变态反应。

2.4 超滤大豆蛋白肽对小鼠半数溶血值 （HC50）的影响

小鼠给予超滤大豆蛋白肽30d后对小鼠半数溶血值（HC50）的影响见表5。

表5 超滤大豆蛋白肽对小鼠半数溶血值（HC50）的影响Table 5 Effect of ultrafiltration soybean peptide on mice hemolysis half value（HC50）

由表5可见，经口给予小鼠不同剂量的超滤大豆蛋白肽30d，与阴性对照组比较，中剂量组动物半数溶血值显著升高（p<0.05），高剂量组动物半数溶血值显著升高（p<0.01），表明超滤大豆蛋白肽能提高小鼠半数溶血值，反应出超滤大豆蛋白肽增强机体的体液免疫功能。

2.5 超滤大豆蛋白肽对小鼠碳廓清功能的影响

给予超滤大豆蛋白肽30d后对小鼠碳廓清能力的影响见表6。

表6 超滤大豆蛋白肽对小鼠碳廓清功能的影响Table 6 Effect of ultrafiltration soybean peptide on mice carbon clearance function

由表6可见，经口给予小鼠不同剂量的超滤大豆蛋白肽30d，与阴性对照组比较，中剂量组和高剂量组吞噬指数显著增加（p<0.05），说明超滤大豆蛋白肽可以增加小鼠碳廓清功能，反应出超滤大豆蛋白肽增强机体的单核-巨噬细胞吞噬功能。

3 讨论

免疫功能分为细胞免疫功能、体液免疫功能和非特异性免疫功能3类。其中，非特异性免疫功能包括单核-巨噬细胞吞噬功能和免疫器官的比值等。本研究选择了3类免疫功能的代表性实验，即反映体液免疫功能的半数溶血值（HC50）的测定、反映单核-巨噬细胞吞噬功能的小鼠碳廓清实验、反映细胞免疫功能的迟发型变态反应（足跖增厚法）以及反映免疫器官的比值的脾脏指数和胸腺指数，观察经口给予不同剂量超滤大豆蛋白肽30d对小鼠各种免疫功能的影响。

结果发现，高、中剂量组超滤大豆蛋白肽半数溶血值显著高于对照组水平，有统计学差异，表明超滤大豆蛋白肽可增强小鼠的体液免疫功能，该结果与国明明等[8]的研究结果一致。Tsuruki T等研究发现大豆中的免疫刺激肽可以提高人嗜中性白细胞的吞噬功能[9]，本研究中，高、中剂量组超滤大豆蛋白肽吞噬指数显著高于对照组，有统计学差异，表明超滤大豆蛋白肽可增强小鼠的碳廓清功能，即单核-巨噬细胞吞噬功能；潘翠玲等研究表明，添喂大豆蛋白酶解物的仔猪胸腺、脾脏的绝对和相对质量均有大幅提高[10]。有研究报道，大豆多肽液提高脾脏指数[11]。但是，在本研究中未见超滤大豆蛋白肽增加脾脏指数和胸腺指数，可能是与本实验选择的实验动物和实验样品不同有关。

国明明等[8]的研究还发现大豆肽可以提高细胞免疫功能，但本研究各剂量组动物足趾厚度差无显著性差异，表明超滤大豆蛋白肽对小鼠迟发型变态反应无影响。这可能与所选择细胞免疫功能的检测实验不同有关，因此，对于大豆肽的细胞免疫功能还需要进一步研究验证。

总之，本研究发现超滤大豆蛋白肽具有增强免疫功能中的体液免疫功能和单核-巨噬细胞吞噬功能。

[1]Paule E G，Jean F L，Sylvie F G，et al.Effect of aggregating peptides on the fractionation of β-LG tryptic hydrolysate by nanofiltration membrane[J].Journal of Membrane Science，2004，234：121-129.

[2]姜曼，宋俊梅.大豆肽的营养功能及其分离纯化方法的研究[J].中国食品添加剂，2009（6）：205-208.

[3]范喜宽，庄磊，赵一敏，等.大豆蛋白活性肽的研究现状及应用前景[J].综述与述评，2009，12（5）：1-4.

[4]Messina M.A brief historical overview of the past two decades of soy and isoflavone research[J].Journal of Nutrition，2010，140（7）：1350S-1354S.

[5]李善仁，陈济琛，胡开辉，等.大豆肽的研究进展[J].中国粮油学报，2009，24（7）：142-147.

[6]Zhong F，Liu J，Ma J G，et al.Preparation of hypocholesterol peptides from soy protein and their hypocholesterolemic effect in mice[J].Food Research，2007，540：663-665.

[7]王红梅，马玲，姚小曼.小鼠廓清实验方法的比较[J].中国食品卫生杂志，2000，12（3）：3-5.

[8]国明明，华欲飞.大豆肽免疫调节作用的研究[J].食品科技，2007（7）：242-244.

[9]Tsuruki T，Kishi K，Takahashi M，et al.Soymetide，an immunostimulating peptide derived from soybean-conglycinin，is an fMLP agonist[J].FEBS Letters，2003（540）：206-210.

[10]潘翠玲，陈伟华，邹思湘，等.添喂大豆蛋白酶解物对早期断乳仔猪免疫组织及器官的影响[J].江苏农业学报，2005，21（3）：212-215.

[11]刘海军，乐超银，邵伟，等.大豆肽对小鼠生理的影响[J].中国酿造，2010，215（2）：82-88.

Effect of ultrafiltration soybean peptide on immune function of mice

FU Xiao-yi，LI Bo-qun，ZHANG Shi-ying，YAO Lei*
（National Research Soybean Engineering and Technology Center Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Objective：To study the effect of ultrafiltration soybean peptide on immune-related functions in mice. Methods：The normal mice were chosen as experimental object in order to observe the effect of different doses（0.85g/kg，1.7g/kg，5.1g/kg）of ultrafiltration soybean protein peptide on spleen index，thymus index，late onset allergy（foot palm thickening method），half hemolysis value and carbon particles clear index in mice.Results：Compared with the control group，the half hemolysis value of high dose and moderate dose of ultrafiltration soybean protein peptide were higher significantly[（51.08±8.33），（38.29±5.51）][（p＜0.01），（p＜0.05）]；the devour index of high dose and moderate dose of ultrafiltration soybean protein peptide were higher significantly[（5.78± 0.69），（5.62±0.57）]（p＜0.05）.However，there were no significant differences among four groups in the aspect of the spleen index，the thymus index and late onset allergy（foot palm thickening method）（p＞0.05）.Conclusion：ultrafiltration soybean protein peptide can strengthen humoral immune function and mononuclear-macrophage phagocytosis function.

ultrafiltration soybean protein peptide；immune-adjustment function；half hemolysis value；late onset allergy

TS201.4

A

1002-0306（2012）07-0375-04

2011－03－18 *通讯联系人

富校轶（1971-），女，高级工程师，研究方向：大豆精深加工技术研究。

黑龙江省国际合作课题。