浓香型皇台大曲可培养细菌群落结构及其产淀粉酶的研究

陈 林，赵志瑞，王 菲，任迪峰，*，李祖明，白志辉

(1.北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083;2.北京联合大学应用文理学院，北京100191; 3.中国科学院生态环境研究中心，北京100085)

浓香型皇台大曲可培养细菌群落结构及其产淀粉酶的研究

陈 林1，赵志瑞3，王 菲1，任迪峰1，*，李祖明2，*，白志辉3

(1.北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083;2.北京联合大学应用文理学院，北京100191; 3.中国科学院生态环境研究中心，北京100085)

采用稀释平板法，从浓香型皇台大曲中分离纯化出73株细菌菌株，经PCR扩增其16S rDNA并测序，比对分析发现这些纯化的细菌菌株中有23株16S rDNA序列各异的可培养细菌，这些菌株分别为Bacillus licheniformis 16株、Bacillus subtilis 2株、Bacillus amyloliquefaciens 1株、Bacillus cereus 1株、Bacillus atrophaeus 1株、Bacillus sonorensis 1株和Brevibacillus sp.1株;采用透明圈法和液态发酵法对大曲中可培养细菌产淀粉酶性能进行检测，结果表明Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis和Bacillus cereus的一些菌株产淀粉酶的活性较高，其中，Bacillus licheniformis的数量最多，是重要的白酒酿造功能菌。

浓香型大曲，细菌群落结构，16S rDNA，淀粉酶

白酒是我国传统的发酵食品，有着悠久的历史。科学技术与酿酒业的发展和酒曲的深入研究，极大地推动了制曲酿酒行业迅猛发展［1－2］。酿酒微生物的种类、数量、分布及其消长变化等对发酵途径及最终产物的生成有着重大的影响，进而影响着白酒的质量［3］。大曲作为一种多酶多菌的微生态制品在白酒酿制中起糖化、发酵和增香的作用［4－6］。大曲是白酒发酵生产中微生物的主要来源，大曲含有丰富的细菌，其各种代谢产物对白酒香型和风格具有重要作用［3，7］。基于传统的表型分类和生理生化鉴定不能准确表现细菌之间的遗传进化关系，以分子生物学为基础的聚合酶链式反应(PCR)技术速度快、准确度高，受到越来越多的关注［8－10］。“南有茅台、北有皇台”，皇台酒是北方浓香型白酒的代表［11］。在前期对皇台酒曲酶系及其生化性能等研究基础上［11］，本文采用PCR技术对皇台酒曲细菌的群落结构进行了研究，并采用透明圈法和液态发酵法对酒曲细菌产淀粉酶的性能作了初步研究，这有利于揭示白酒酿造的机理和实现白酒生产的科学化和现代化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

酒曲 由甘肃皇台酿造(集团)有限责任公司提供;肉膏蛋白胨培养基(g) 牛肉膏0.5，蛋白胨1， NaCl 0.5，琼脂1.5～2，水100mL，pH7.2;淀粉培养基 可溶性淀粉2%，蛋白胨1%，NaCl 0.05%，琼脂2%，pH7.2;种子培养基 牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH7.2;摇瓶培养基 可溶性淀粉2%，蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，调pH7.2;灭菌温度121℃，灭菌时间20min;通用引物27F、1495R 由上海竹工公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 酒曲微生物的分离纯化

1.2.1.1 酒曲悬液的制备 用灭过菌的小刀，除去曲坯表面，于内部取曲粉5g，用无菌的研钵研碎成粉。在无菌环境称取要分离酒曲粉1g，放入含有玻璃珠的灭菌三角瓶中，用99mL无菌生理盐水稀释，在摇床上振荡15min混匀即为1∶100的稀释液。用灭菌吸管吸取1∶100稀释液0.5mL，沿管壁徐徐注入含有4.5mL无菌生理盐水的试管中，振摇试管混合均匀，制成1∶1000的稀释液。另取灭菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增稀释液，一直稀释到10－8倍为止。

1.2.1.2 稀释涂平板 用灭菌吸管从稀释度为10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8的稀释液中吸取0.1mL菌液分别涂肉膏蛋白胨培养基平板3块。

1.2.1.3 培养 倒置培养皿，在培养温度为36℃的恒温培养箱中培养一段时间，菌落长成后即可计数。

1.2.1.4 菌落计数、形态描述、纯化培养 对长出的菌落进行计数、形态描述，然后挑取平板上的单菌落分别在肉膏蛋白胨培养基上进行划线分离，于36℃下培养一段时间，进一步纯化，直到得到单一菌落。

1.2.1.5 斜面保存 挑取纯化后的单个菌落，接入肉膏蛋白胨斜面培养基斜面中保存备用。

1.2.2 细菌16S rDNA测序分析

1.2.2.1 PCR 16S rDNA扩增:引物为通用引物27F和 1495R［12］，其 序 列:正 向 引 物:5’－AGAGTTTGATCMTGGCTCAG－3’;反向引物:5’－TACGGYTACCTTGTTACGACTT－3’。

聚合酶链式反应(PCR):反应体积为50μL;扩增条件为 95℃ 5min，94℃ 1min，52℃ 1min，72℃1.5min，30个循环;72℃下延伸7min。PCR产物经切胶纯化回收后送北京六合华大基因测序公司测序。

1.2.2.2 测序和分析 将所得16S rDNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行Blast比较，找到与分离菌株亲缘关系最近的种属。并从数据库获得相关种属中相似性最高菌株的16S rDNA基因序列，使用MEGA3.1进行比对，用N－J法构建系统发育树。

1.2.3 细菌产淀粉酶的测定

1.2.3.1 初筛 将分离纯化菌株点种于淀粉培养基平板［13］上，于36℃恒温培养箱中培养一段时间，菌落长成后向平板中倒入碘液显色，观察并测定透明圈直径和菌落直径的大小，并计算其比值(HC值)，初步筛选出产淀粉酶优良的菌株。

1.2.3.2 淀粉酶的制备 将透明圈法筛选出来的产淀粉酶的菌株接种于细菌种子培养基上(20mL于150mL锥形瓶中)，于摇床180r/min 36℃培养24h，得种子液，按6%接种于细菌淀粉酶摇瓶培养基(50mL于250mL锥形瓶中)，于摇床180r/min 36℃培养48h，取发酵液于离心管中，8000r/min，4℃，离心15min，取上清液即为淀粉酶粗酶液，于冰箱保存备用，测淀粉酶活力。

1.2.3.3 淀粉酶活力测定 将粗酶液稀释代替蒸馏水，用2%可溶性淀粉溶液作为底物按照上述操作，660nm下测吸光度A，通过标准曲线查出相应的淀粉浓度，即被酶消耗的淀粉量。

1.2.3.4 酶活力计算 酶活力以每毫升粗酶液在60℃，pH6.0的条件下每小时所分解的淀粉微克数来衡量。

2 结果与分析

2.1 群落结构解析

2.1.1 分离筛选 通过倍比稀释法和平板划线分离法，对浓香型皇台酒曲中细菌进行分离和纯化，从中筛选出细菌73株，通过16S rDNA的分子鉴定可进一步确定这些菌株的种属关系。

2.1.2 群落结构解析 对从酒曲中分离筛选的细菌菌株的16S rDNA进行PCR，并对纯化后的PCR产物进行测序，获得皇台酒曲细菌菌株的16S rDNA全序列，与GeneBank中序列比对确定细菌种属。一般认为，细菌16S rDNA序列相似性大于99%可以认为是相同的种。本文又将16S rDNA序列相似性为100%的菌株合并为相同的菌株，序列递交GenBank数据库，获得登录号。结果见表1。皇台酒曲细菌菌株系统进化树见图1(A和B)。

皇台酒曲中 73株菌株中包括 Bacillus licheniformis 44株，占 60.3%;Bacillus cereus 10株; Bacillussubtilis7 株;Bacillus sonorensis7 株; Brevibacillus sp.3株;Bacillus amyloliquefaciens 1株和Bacillus atrophaeus 1株。菌株的16S rDNA序列完全相同的合并后，得到23株不同菌株，分别为Bacillus licheniformis 16 株、Bacillussubtilis 2 株、Bacillus amyloliquefaciens 1株、Bacillus cereus 1株、Bacillus atrophaeus 1株、Bacillus sonorensis 1株和Brevibacillus sp.1株。可见，浓香型皇台酒曲细菌数量繁多、种类丰富，芽孢杆菌是优势菌。

芽孢杆菌广泛存在于酒曲中。研究人员分别采用不同方法从泸州国窖酒曲［14］、茅台高温大曲［15］、汾酒酒曲［16］中分离检测出不同芽孢杆菌菌种。相关文献报道地衣芽孢杆菌是酱香型白酒高温大曲中特有微生物［17］，和本文研究结果一致。庄名扬等［18］采用纯培养和经典鉴定发现酱香型白酒的功能菌B3－1菌株属地衣芽孢杆菌。牛栏山二锅头清香型大曲中地衣芽孢杆菌的应用为提高牛栏山二锅头基酒质量提供了良好的途径［19］。

除地衣芽孢杆菌外，枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌也是皇台大曲中重要的功能菌群。枯草芽孢杆菌［20］在酱香生产中起重要作用。蜡状芽孢杆菌［21］有较强的分泌淀粉酶能力。目前还未见 Bacillus sonorensis、Brevibacillus sp.、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus atrophaeus存在于其他大曲的文献报道。以上对浓香型皇台大曲细菌群落结构的研究为其深入研究和应用奠定了基础，有利于揭示浓香型白酒酿造的微生物学机制。

2.2 酒曲中产淀粉酶的细菌

淀粉酶是能水解淀粉转化成葡萄糖、麦芽糖及一些低聚糖的一类酶的总称，广泛应用于酿酒、食品、医药、纺织、饲料等领域［21］。淀粉酶可将淀粉液化和糖化，有利于白酒酿造，是白酒生产中必需的重要酶类，其酶活的高低极大地影响原料利用率、白酒产率及风味品质。目前分离产淀粉酶细菌的方法，主要是使用淀粉培养基进行分离，然后用碘液染色检测透明圈的大小，从而鉴定出产淀粉酶的菌株［22］。对筛选出来的甘肃皇台酒曲中的细菌进行淀粉平板透明圈实验，得到产淀粉酶的菌株，并将这些菌株进行接种发酵，研究其产淀粉酶的性能，结果见表2。

从甘肃皇台酒曲中分离纯化的73个细菌菌株中，有12株(见表2)能在淀粉平板中形成明显的透明圈，说明它们能产生淀粉酶;其中 Bacillus licheniformis 5株，占41.7%，是皇台大曲中产淀粉酶细菌的优势菌;Bacillus subtilis 3株，Bacillus cereus 2株，Bacillus sonorensis 2株，而 Brevibacillus brevis和Bacillus atrophaeus未产生明显的淀粉透明圈。由表2可知，不同酒曲细菌菌株产淀粉酶活力有所不同; Brevibacillus sp.和Bacillus atrophaeus中没有发现明显产淀粉酶的菌株，这与透明圈实验结果相一致。另一方面，不同的细菌菌株，即便是16S rDNA序列完全相同，它们产淀粉酶的能力差别仍然较大，因此，从分类学上严格划分，它们可能不是相同的菌株，或许划分为亚种水平更准确，还有待深入研究。

表2 酒曲细菌产淀粉酶Table 2 Amylase－producing bacteria from Daqu

目前已有学者从酒曲中分离出具有产淀粉酶活性的菌株。翁庆北［23－24］等从茅台酒曲和习酒酒曲里得到产淀粉酶的多种芽孢杆菌，如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌等;可以看出地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌均是大曲细菌中产淀粉酶的重要菌群。未见大曲中Bacillus sonorensis和Bacillus amyloliquefaciens产淀粉酶的文献报道。

图1 皇台酒曲细菌菌株系统进化关系树Fig.1 Phlogenetic analysis of Huangtai cultivable bacteria

3 结论

本文对浓香型皇台大曲中细菌进行分离筛选得到73株细菌。经过16S rDNA扩增测序后发现Bacillus licheniformis占总数量的60.3%，是大曲的优势菌，其次为Bacillus cereus和Bacillus subtilis;未见Bacillus sonorensis、 Brevibacillus brevis、 Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus atrophaeus存在于其他大曲的文献报道。发酵产淀粉酶性能研究发现Bacillus licheniformis数量上占明显优势，所产淀粉酶活力较高;未见大曲中Bacillus sonorensis产淀粉酶的文献报道。初步研究发现不同细菌菌株，即便是16S rDNA序列完全相同，它们产淀粉酶的能力差别仍然较大。因此，后续工作将对产淀粉酶能力差异大且具有相同序列的菌株在亚种水平划分进行深入研究。

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Study on the cultivable bacterial community structure and amylase in Huangtai Liquor Daqu

CHEN Lin1，ZHAO Zhi－rui3，WANG Fei1，REN Di－feng1，*，LI Zu－ming2，*，BAI Zhi－hui3
(1.College of Biological Sciences and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China; 2.College of Arts and Science of Beijing Union University，Beijing 100191，China; 3.Research Centre for Eco－Environmental Sciences，Chinese Academy of Science，Beijing 100085，China)

The cultivable bacterial community structure in Huangtai Liquor Daqu was assessed by dilution plate method and 16S rDNA gene directed PCR.The producing ainglase property of bacteria in the Daqu was investigated by clear zone and submerged fermentation(SmF).23 strains of cultivable bacteria isolated from HuangtaiDaqu were identified as Bacillus licheniformis，Bacillus subtilis，Bacillus cereus，Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus atrophaeus，Bacillus sonerensis and Brevibacillus sp.respectively.That the strains of Bacillus licheniformis produced amylase were the most abundant bacteria in the Daqu，as well as effective amylase producer.Bacillus licheniformis might play an important role in the brewing of Huangtai liquor.

luzhou－flavor Daqu;bacterial community structure;16S rDNA;amylase

TS201.3

A

1002－0306(2012)08－0232－05

2011－06－10 *通讯联系人

陈林(1986－)，女，硕士研究生，研究方向:农产品加工与贮藏。

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(YX2011－21，TD2010－3);北京市教委科研计划项目(KM200811417006);北京市属市管高校人才强教计划资助项目。