亲代GATA4基因变异对子代发生先天性心脏病的影响

彭 婷，王 丽，程 琰，郭奇桑，李笑天

(1.复旦大学附属妇产科医院，上海 200011;2.中国福利会国际和平妇幼保健院辅助生殖医学中心，上海 200030)

先天性心脏病(先心病 congenital heart disease，CHD)在出生缺陷病因中占首位，在新生儿中发病率约8‰。先心病的病因还未明确。近年来认为心脏发育转录因子GATA4基因突变在先心病发病中有重要作用。GATA4基因突变可能遗传自父母，也可能来源于环境诱变。国外报道在先心病患者中检测到的NKX2.5基因突变位点，在心脏正常的父母DNA上也可以检测到，这种现象甲状腺先天异常研究中也存在［1］。但目前国内关于父母遗传对子代先心病发病影响方面报道很少。本文拟从先心病患者父/母角度，分析GATA4基因编码链的突变情况，了解父母遗传因素对子代发病影响情况。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 病例组父代 2005－2006年复旦大学附属儿科医院心血管中心的住院先心病患儿135例均经超声心动图、心导管检查或外科手术确诊。经入院查体检测是否为综合症型心脏病，心脏畸形分型见表1。所有研究对象均为汉族，无血缘关系。其中父亲43例，母亲92例。父母均取到为2例，共137例。

135例先心病中有3例有家族史，其家族史情况见表2。3例有家族史患者父母均体健，且先心病表型与家族中患病者均不同，考虑不是有显性主基因参与的多基因遗传模式。有1例为Down’s综合症患儿，区别于其他非综合征型先心病患儿。

1.1.2 对照组父代 经产前检查没有心脏畸形的正常人114例，为正常志愿者和复旦大学附属妇产科医院产检的孕妇。父5例，母109例。

表1 135例先天性心脏病患者心脏畸形分类

表2 先天性心脏病家族史及Down综合症患儿

1.2 实验方法

1.2.1 血标本的采集和基因组DNA的提取 抽取父亲或母亲外周静脉血2 ml，加入68 mmol/LEDTA 40 μl抗凝，采用U-geneDNA血液基因组DNA抽提试剂盒(安徽优晶生物 H.Q.＆.Q.Blood DNA Kit I)按操作手册提取基因组DNA。

1.2.2 引物设计及PCR反应 采用Primer 5.0软件设计引物，将GATA4基因根据GeneBank中公布的DNA标准序列 ，使扩增产物完全覆盖基因的全部编码序列和部分非转录区域，并设计上游引物包含部分内含子，避免非特异性扩增。共设计7对引物，引物由上海生物工程公司合成。Tm指PCR退火温度，Dtm指DHPLC检测温度。反应体系为25 μl:10 uM 正向及反向引物 0.5 μl;10ⅹbuffer 2.5 μl;10mMdNTP 0.5 μl;100%DMSO(二甲基亚砜)1.25 μl;Taq 酶(5U/μl)0.25;基因组 DNA 模板(50 ng/μl)2 μl;ddH2O 17 μl。循环参数为:95℃预变性5 min;94℃变性30s;58～61℃退火30s;72℃延伸30s;循环35次;72℃终延伸7min。PCR反应在ABI PRISM3700型PCR扩增仪上进行。扩增完毕，取反应产物5 μl与1 μl溴酚兰加样缓冲液充分混合后，加样于2%琼脂糖凝胶点样孔中电泳，电压120V，电泳15 min，停止电泳后，紫外灯观察结果并照相保存。使扩增效率良好并具有重复性。

1.2.3 DHPLC分析 将 GATA4基因根据 Gene-Bank中公布的标准序列引入WAVEnavigator软件(美国 Transgenomic公司)查找预测的融解温度。首先分别在理想融解温度±2℃范围内以不同的温度进行试验测定，试验确定最适实际融解温度，以免遗漏DNA片段中的突变点，分析柱保留时间为8 min。

20 μl PCR产物经过PCR仪上95℃保留10 min变性后放入WAVE系统96孔反应板上，进样、检测和分析，根据样本峰高幅度设定样本吸取量，保持每个样本峰值均达到5 MV左右。首先检测了10个标本GATA4基因的7个扩增片段，证实峰型重复性佳后，再进行全部患者及对照组的筛查。仪器用缓冲液包括A液:0.1 mol/L的三乙基胺乙酸盐(Triethyl ammonium acetate，TEAA);B 液:0.1 mol/L的TEAA和25%的乙腈。根据不同片段的解链温度，检测系统将按线性递增方式，以0.9ml/min的流速自动将结合在检测柱上的DNA分子洗脱下来，在260 nm处读取吸光值，经系统自动处理后，信号被输送到监视屏上，形成DHPLC峰型图谱。根据图形重复性比对异常峰型。

重复扩增有异常峰型的PCR产物，进一步检测验证，如重复出现异常峰型，PCR产物测序分析。对出现SNP的片段，将单一峰型样品以2∶1与测序证实野生型样品混合后预处理同前，DHPLC检测，如出现异常峰型说明为纯合突变，仍为单一峰型为野生型。

1.2.4 测序分析 DHPLC检测发现的异常峰型标本进行DNA直接测序以明确序列变异的位点及类型;测序反应所用测序仪器为ABI PRISM 3730，测序试剂为 BigDye terminator v3.1。

应用Blast软件将测序结果与GeneBank中的基因标准序列比照，应用Chromas软件对应氨基酸序列比对可能引起的氨基酸序列改变。

1.3 统计学分析 检测到的多态位点按分类变量统计，基因型频率及基因频率组间差异应用SPSS进行卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR结果 137例标本经PCR分段扩增GA-TA4基因编码序列，所有PCR结果经过琼脂糖电泳验证与DNA marker比照，各片断的PCR反应产物的长度与所设计的各片断大小预期值符合，特异性理想。

2.2 DHPLC检测结果 取3例标本在50℃非变性温度下，检测扩增片段DHPLC分析效果，未见杂峰，分析效果佳，见图1。

图1 GATA4基因扩增片段DHPLC未变性条件下反应体系验证图

经DHPLC检测，病例组及对照组GATA4exon1的S1和S2各出现两种峰型，S1短片段异常峰型在对照组及病例组中多次出现。S2片段仅在一位法洛四联症患者父亲有异常峰型，对照组中未发现此异常峰型，外显子4片段病例组及对照组中均出现3种峰型:单峰、双峰及四峰。重新进行PCR扩增具有异常峰型的样品进行DHPLC检测，出现相同峰型，进一步测序分析。

2.3 测序结果

2.3.1 基因错义突变 GATA4基因exon1 S2片段对应的异常峰型测序证实为 c.-487C＞T(表2)。编码链第487位碱基C转换为T，导致163位密码子由CCG转换为CTG，编码的氨基酸由脯氨酸转换为丝氨酸P163S(p.Pro163Ser)，错义突变的测序见图2。

表2 先心病患者父代GATA4基因变异情况

图2 先心病患者父代GATA4基因错义突变测序图

2.3.2 基因多态性 GATA4基因exon1 S1片段对应的序列变异为编码链第99位碱基由G转换为T(c.-99G＞T)，导致33位密码子由 GCG转变为GCT。由于第3个密码子为简并密码子，碱基替换后仍编码Ala，所以事实上系同义突变(Ala33Ala)。

GATA4基因exon4发现两种序列变异:双峰对应的序列变异为内含子DNA序列第50745位碱基由A转换为T，四峰对应的序列变异为内含子DNA序列50946位碱基由A转换C，形成杂合子。SNP的测序图见图3。

图3 先心病患者父代GATA4基因SNP测序图

2.3.3 病例组和对照组父代基因型构成比的比较 先心病父母组存在GATA4基因多态性，比较单核苷酸多态性在父母中的基因型和等位基因频率，病例组与对照组没有统计学差异(P＞0.05)(表3)。

表3 CHD患者与正常对照组父代GATA4基因多态性基因型构成比较

3 讨论

本研究是国内首次报道在先心病患者父亲中也发现了心脏发育转录因子GATA4基因的Pro163Ser突变。GATA4基因在心肌细胞的表达是心肌细胞增殖、心内膜垫形成、右室正常发育和流出道分隔形成所必须的。GATA4蛋白表达水平的微小变化就能显著影响心脏形态和胚胎存活［2］。GATA4缺失的小鼠在胚胎发育第8～9天因心脏发育畸形而死亡，或由于胚胎腹侧不能融合而出现心管分叉，形成两个心管。Pro163Ser定位于GATA4基因的转录激活区域2(TAD2)，GATA4基因有两个转录激活域(TAD)，两个Ⅳ型锌指结构和一个核定位信号，功能分析认为这两个进化中保守的转录激活区域在脊椎动物发育过程中有重要的转录调节作用。至今为止，仅Kayoko等［3］在TAD区域发现一个错义突变Ser52Phe。因此认为这个区域的突变Pro163Ser可能是先心病的重要致病原因。

Rajagopal等［4］首次报道高加索患者 Pro163Ser突变时，检测患者无心脏病史的父亲血液基因组DNA，也检测到相同Pro163Ser突变位点。本研究与国外报道相同，患者父亲既往体格检查未提示存在先心病，先心病患者血液基因组DNA也发现了Pro163Ser位点突变［5］。先心病患者所得到的遗传信息一半来自父亲，一半来自母亲。因此先心病患者父母理论上可能携带相同的致病突变位点。Goldmuntz等［6］在法洛四联症患者患有室间隔缺损的一级亲属血液基因组NKX2.5基因突变检测到与患者相同的突变。GATA4基因Pro163Ser突变可能作为外显不全的突变位点，存在于患者一级亲属中。根据多基因遗传病阈值理论解释，单基因位点突变不一定导致先心病发生，可能需其他因素协同累计达到发病阈值。

本研究还检测到3个新的单核苷酸多态性位点，一个位于外显子区域Ala33Ala，在临近外显子4的内含子区域也检测到两个单核苷酸多态性。3个单核苷酸多态性位点查找dbSNP(NCBI)目前均未见报道。同义突变传统观点认为未导致氨基酸一级结构改变，不影响蛋白质的高级结构，因而不致于引起蛋白功能变化，所以不会成为致病的原因。但近年来随着对基因调控区、内含子等翻译区突变的研究，发现同义突变虽不引起氨基酸序列的改变，基因编码区内出现的同义突变可由于同义密码子的使用偏性，导致翻译效率不同或转录水平差异而导致蛋白质表达量上的改变。Evans等［7］发现编码P－糖蛋白的ABCB1基因第26外显子上的同义突变C3435T可以使地高辛的生物利用率明显升高。钙敏感受体基因CaSRintron5多态性影响血清Ca2+的浓度，对甲状旁腺功能亢进的严重程度有作用。密码子同义突变不但改变mRNA茎环结构，还会影响mRNA的降解速率。对于含CG丰富的mRNA，降解速率明显慢于含AT丰富的mRNA，这可能与CG间有着更强的结合能有关［8-9］。因此，同义突变可能通过转录后水平，翻译后修饰等环节来影响蛋白质功能导致疾病发生。通过比较先心病病例组与对照组基因型和等位基因频率，无显著性差异，按CHD类型分型再比较，病例组与对照组相比差异也没有显著性。但由于样本量较少，还有待于进一步扩大样本量分析。基因型构成分析显示符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。表明本研究对照的位点多态性已达到遗传平衡，有群体代表性。

本研究在GATA4基因的外显子边缘的内含子区域位点发现2个碱基转换和颠换S50745A＞T及S50946A＞C。有证据表明，曾被认为是无编码意义和无确切生物功能的内含子，虽然在mRNA加工过程中被剪切掉，但仍具有其特定的功能，至少在维持mRNA前体稳定性、翻译和转录过程的调节中发挥重要作用［10］，甚至在进化过程中承受一定的选择压力。

总之，本研究发现在先心病患者正常的一级亲属中也可以存在GATA4基因的Pro163Ser突变位点。随着基因组研究的发展，有望可以发现所有父母携带的可能对先心病发病有影响的基因变异，进一步提高先心病的产前诊断和优生优育。

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