功能性短肽的分类及其酶解制备方法

李昊剑，杨良嵘，魏雪团，邢慧芳，刘会洲

(生化工程国家重点实验室，绿色过程与工程院重点实验室，中国科学院过程工程研究所，北京 100190)

功能性短肽的分类及其酶解制备方法

李昊剑，杨良嵘*，魏雪团，邢慧芳，刘会洲

(生化工程国家重点实验室，绿色过程与工程院重点实验室，中国科学院过程工程研究所，北京 100190)

近年来，蛋白质中功能性短肽的营养、功能性、生理活性和其应用价值越来越引起人们的关注。功能性短肽来源广泛，通过合适的蛋白酶酶解得到的功能性短肽，具有诸如降血压、提高免疫力、促进消化、抗氧化、神经调节和抗菌等生物活性。本文综述了功能性短肽的来源和分类，讨论了植物蛋白源短肽和动物蛋白源短肽的特点，通过选择蛋白酶和优化酶解条件分析了酶解制备短肽的方法，为开发和深入研究功能性短肽产品提供理论依据。

功能性短肽，分类，酶解，制备

随着现代生物技术和生物科学的发展，各种新的功能性短肽不断地被发现，其具有很高的开发价值，研究功能性短肽越来越受到人们的重视。肽是由2个及2个以上氨基酸分子通过肽键相互连接的线性聚合物。含2个、3个、4个氨基酸脱水缩合而成的肽分别称之为二肽、三肽、四肽。一般说来，肽链上氨基酸残基10个以下，特别是3～9个氨基酸聚合而成的肽称短肽，也称寡肽，含氨基酸10到50个的称为多肽，50个以上的称蛋白质［1］。一般认为，功能肽性短肽是特定的蛋白质片段，具有一定生理调节功能的肽类混合物。很多研究发现，蛋白质在人体内更多是以短肽的形式进行吸收，在肠道中，蛋白质通过消化酶酶解后，短肽以完整的形式被吸收而进入血液循环系统。这类特殊的蛋白质片段对机体的功能及状态具有积极作用，并最终可能促进机体健康［2］。功能性短肽具有多种功能性、高效、安全等优势，已越来越多的引起人们重视，其工业化生产也成为当前多肽类药物和功能性食品添加剂开发的趋势［3］。本文概述功能性短肽的分类以及蛋白酶酶解制备短肽的方法，为功能性短肽产品的研发和推广提供参考。

1 功能性短肽的分类

由于功能性短肽种类繁多、功能各异、来源广泛。因此，还没有一套统一的分类标准。根据制备短肽来源的不同，本文将其分为植物蛋白源短肽和动物蛋白源短肽［4］。

1.1 植物蛋白源短肽

1.1.1 大豆短肽 大豆短肽是大豆蛋白经过蛋白酶酶解或微生物发酵后，再经过特殊处理，包括分离、脱色、脱苦等工艺条件而得到的短肽化合物，其通常由3～6个氨基酸分子组成［5］，相对分子量一般在300～1500u之间，同时含有少量游离氨基酸、糖类和无机盐。大豆短肽还能够调节人体生理功能，例如防治血栓、降血脂、降血压、抗疲劳、提高机体免疫力、促进微量元素的吸收等［6］。大豆蛋白在蛋白酶的作用下水解成短肽，氨基酸组成与大豆蛋白质相近［7］，如表1所示。李志忠［8］等测定了大豆肽产品中短肽质量分数为76.33%，人体所需的8种必需氨基酸的总质量分数为24.94%，游离氨基酸质量分数约为26.33%，表明大豆肽具有较高的营养价值。最常见的大豆短肽有以下几种:易消化肽、抗肥胖肽、抗氧化性肽、降血脂肽等。

大豆多肽中具有多种容易消化的短肽，它们主要以低于五肽的形式存在，蛋白质经过人体消化道酶水解后，主要以短肽的形式吸收，而且比游离的氨基酸更容易吸收。因此，对于那些对蛋白质的吸收有困难的人群，例如营养不良、术后康复的病人，消化机能衰退的老年人，这类人群所需要的营养可以用大豆多肽来代替。大豆短肽通过降低对食物的吸收而显现出具有减肥作用的抗肥胖活性，例如大豆球蛋白亚基上的一段短肽片段 Leu－Pro－Tyr－Pro－Arg［9］，可以在足够能量摄入的基础上，降低剩余能量成分的吸收，达到减肥降脂的功效。一些大豆短肽具有抗氧化活性，日本学者用蛋白酶S酶解β－伴大豆球蛋白，从酶解液中分离出六种抗氧化活性肽，其中分子量最小的短肽，Leu－Leu－Pro－His－His，是基于亚油酸氧化作用下，才具有抗氧化活性的［10］。大豆蛋白是一种典型的降胆固醇和血脂的蛋白质，大豆蛋白酶解后的短肽不但可以降低胆固醇，还能防止胆汁的重吸收和动脉粥样硬化的发生［11］。韩国学者星俊祖［12］证明大豆蛋白水解液(SPH)里的短肽具有降低胆固醇的作用，具体机制是大豆水解液中的短肽能够有效刺激脂蛋白受体(LDL－R)的转录，上调LDL－R转录可能会增强体内分解代谢或减少细胞内胆固醇合成。

表1 大豆肽的氨基酸含量Table 1 Amino acid content of soybean peptides

1.1.2 小麦短肽 小麦蛋白又叫做“谷朊粉”或“面筋蛋白”，是小麦淀粉的副产物，小麦蛋白质含量丰富，可达72%～85%，具有很高的营养价值［13］。小麦蛋白的应用可以提高小麦深加工中副产物的利用率，提高小麦产品的附加值。近年来，通过酶解小麦来制备具有生物活性的功能性短肽也成为了研究的热点。张亚飞［14］等人用碱性蛋白酶水解小麦蛋白所得的小麦肽混合物，经过实验鉴定了小麦肽混合物中含有对小鼠体外淋巴细胞增殖具有刺激作用的活性肽，并具有免疫活性。Wang［15］比较了不同氧化系统作用下的商业抗氧化剂和用木瓜蛋白酶水解小麦蛋白得到的短肽混合物之间的抗氧化活性的区别。Matsui［16］等人从小麦胚芽蛋白的水解物中分离出几种血管紧张素I型转换酶抑制肽，这些短肽对降低血压有很好的效果。

1.1.3 玉米短肽 与小麦蛋白主要集中在胚芽中不同的是，玉米中的蛋白质75%在胚乳中，20%在胚芽中。玉米短肽是玉米蛋白的水解产物，但工业上制备玉米短肽是以玉米蛋白粉为原料，玉米蛋白粉是从玉米淀粉分离蛋白质后得到的不溶于水的滤渣，是淀粉的主要副产物。由于玉米蛋白难溶于水，很大程度上限制了其在食品工业上的应用，造成了很大的浪费。玉米蛋白粉主要含有醇溶蛋白，该蛋白中含有较多的支链氨基酸和中性氨基酸，因此玉米肽属于高F值低聚肽。张强［17］以玉米蛋白粉为原料，用碱性蛋白酶水解得到的玉米抗氧化肽对氧离子和氢氧根离子有很强的清除作用，清除率分别达到54%和82%。

1.1.4 花生短肽 花生饼粕是指以脱壳花生果为原料，经压榨提取油以后的副产物，营养价值高，粗蛋白含量30%以上，但花生饼粕很容易感染黄曲霉菌产生黄曲霉素，进而对食品药品饲料行业的生产有一定的影响。近年来，科技工作者们对一系列具有抗氧化性、抗真菌［18］、降血压活性的花生功能性短肽也进行了大量的研究。

1.2 动物蛋白源短肽

动物蛋白源的功能性短肽主要有乳蛋白源短肽、鱼蛋白源短肽、肉蛋白源短肽［19］、血蛋白源短肽［20］、蛋源蛋白短肽［21］等，但研究比较深入的是乳蛋白源短肽，是指利用蛋白酶酶解乳蛋白并从酶解液中提取具有各种生物活性的功能短肽。畜禽类乳中含有包含大量酪蛋白、球蛋白、调节因子和生长因子，以酪蛋白为主，酪蛋白包括 αs1－酪蛋白、αs2－酪蛋白、β－酪蛋白和κ－酪蛋白四种类型［22］。其中αs－酪蛋白和β－酪蛋白属于高度磷酸化的蛋白，β－酪蛋白含有5个磷酸丝氨酸基团。酪蛋白约占到总蛋白80%［23］，其不仅具有营养作用，还具有重要的生理功能。大多数酪蛋白易受到胃肠道中内源性酶的降解，酶解后的短肽一般都具有特殊的生物功能性［24］。按照乳蛋白源短肽的功能和来源大致分为以下三类:

1.2.1 影响免疫系统的乳蛋白源短肽 影响免疫系统的乳蛋白源短肽包括免疫调节肽、抗菌肽和抗癌症肽。酶解乳蛋白、酪蛋白和乳清蛋白，得到具有免疫活性的功能性短肽，可以影响细胞的免疫系统和下游免疫应答和细胞功能［25］，使淋巴细胞增殖，促进细胞因子和抗体的合成，在体内发挥着重要的免疫调节作用。有临床科学家证明，乳蛋白源短肽可以显著提高人体免疫特性，从而影响人体健康。Jolles［26］等人首次由胰蛋白酶酶解人乳蛋白，得到一段具有免疫活性的多肽链，氨基酸序列式 Val－Glu－Pro－Ile－Pro－Tyr，该短肽能够增强小鼠腹腔中巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用和抗肺炎克氏杆菌的侵染。Migliore－Samour［27］等人发现酪蛋白源免疫活性肽可以抵抗克雷伯菌属对大鼠免疫系统的侵入。Otani［28］等人研究发现小鼠口服血清和免疫球蛋白源短肽可以减轻过敏反应，提高消化道粘膜细胞的免疫力。Lopez－Exposito［29］研究了胃蛋白酶消化牛κ－酪蛋白，表明κ－酪蛋白源短肽片段对一些革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都具有抗菌作用，并对这些短肽的氨基酸序列进行了分析讨论。

1.2.2 影响消化系统的乳蛋白源短肽 影响消化系统的乳蛋白源短肽主要是指酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopetides，CPPs)，酪蛋白磷酸肽是以牛乳蛋白为原料，一般通过胰蛋白酶水解得到的功能性短肽。CPP分子由三十多个氨基酸残基组成，包含4～7个成簇的磷酸丝氨酸残基。其能够有效促进人体吸收二价金属离子，如钙离子、铁离子和锌离子等，形成可溶性盐来增加在肠道中的浓度，提高金属离子的吸收利用率，因此CPP成为了营养保健食品当中主要的矿物元素吸收促进剂，能真正达到有效补充人体缺乏的矿物元素的目的。

CPP还具有抗龋齿的功能，乳酪中的CPP能将食物中的钙离子结合到牙齿上，减轻牙釉质的去矿物化，从而达到抗龋齿的目的［30］。Corss［31］的研究表明，CPP可以稳定氯化钙磷酸盐可溶性络合物，在预防龋齿和牙釉质早期阶段的修复治疗方面具有卓越的临床疗效。Yamaguchi［32］在不破坏牙釉质的情况下，用超声波脉冲测定牙釉质结构的去矿化和再矿化，得出了高浓度的CPP－ACP中的无机成分能够加强牙釉质结构的再矿化。

1.2.3 影响神经系统的乳蛋白源短肽 阿片肽(opioid peptides)又称安神麻醉肽或类吗啡活性肽，是最先在中枢神经系统中发现的一种神经激素，因其具有和吗啡相似的生物效应，故叫做类吗啡肽。可以调节与神经网络相关的情绪、呼吸、脉搏和内分泌等功能［33］。阿片肽分为内源性和外源性两种，内源性阿片肽包含脑啡肽、内啡肽、强啡肽等;外源性阿片肽存在于外源性的食物当中，也称作外啡肽、外援吗啡或是无激素，其中乳蛋白源的阿片肽是主要的来源［34］。Clare发现乳蛋白源短肽可以直接作用于神经系统。研究发现，在牛和人类κ－酪蛋白酶解后的短肽或化学合成的短肽中，不仅存在阿片肽，还存在与阿片肽相拮抗的物质，称为阿片受体拮抗剂。Chiba［35］化学合成牛 κ－酪蛋白片段 Tyr－Pro－Ser－Tyr－Gly－Leu－Asn和胰蛋白酶消化得到的序列是Tyr－Pro－Tyr－Tyr的短肽，在豚鼠回肠中均检测到阿片受体拮抗活性。

乳蛋白源肽还包含一些和谷物蛋白肽相同的功能肽，例如抗高血压肽、抗血栓肽、以及各种转化生长因子。

2 酶解法制备功能性短肽

多肽的制备方法一般分为化学水解法、化学合成法、DNA重组技术合成法、微生物发酵法和蛋白质酶解法。化学水解法是采用酸或碱等化学试剂的作用下，使蛋白质分子的肽链断裂成小分子多肽。该方法简单易行，但是确有水解纯度低、产品质量差异大、氨基酸损失大、成本高、试剂毒性大等缺点和难点。化学合成法虽然能合成具有固定结构和固定生物活性的多肽，但由于合成中毒性大和成本高的原因，在实际生产中很少采用。DNA重组技术合成法是用基因工程等分子生物学技术合成大分子肽和蛋白质，但是近几年，欧美等国家的消费者都认为基因工程食品或药品可能对人体有一定的伤害和危险，所以目前使用得比较少。微生物发酵法制备功能性短肽，由于微生物发酵机理和代谢途径较为复杂，导致发酵进程不易控制，生产时间长，产品的稳定性差。

相对于以上短肽制备方法，蛋白酶酶解法制备短肽具有成本低、安全性好、生产条件温和、水解容易控制、对设备条件要求不高、便于工业化生产的优点，最重要的是因为其没有有机溶剂残留和有毒的化学物质［36］，因此工业上制备功能性短肽较为常用的生产方法是蛋白酶酶解法。本文认为酶解法制备功能性短肽主要包括两部分内容:蛋白酶的选择和酶解工艺条件的优化。

2.1 酶解法中蛋白酶的选择

在短肽的制备中酶的选择是关键，不同蛋白酶的活化中心不同，所能水解的蛋白也不同，在短肽的产率、含量和性质上存在很大的差异，直接影响产品的风味和理化特性。本文根据蛋白酶来源的不同，把蛋白酶酶解法制备功能性短肽分为植物蛋白酶酶解法、动物蛋白酶酶解法和微生物蛋白酶酶解法。

2.1.1 植物蛋白酶酶解法 植物蛋白酶来源比较广泛，如剑麻、菠萝、无花果、猕猴桃、木瓜等都具有高活性的蛋白酶。植物蛋白酶相对于微生物蛋白酶在食品行业中的应用来说，不需要做毒理实验和临床实验证明酶和多肽有无危害性，可以直接使用。并且植物蛋白酶多是来源于生产的下脚料和副产品。

Yang［37］等用菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶在半个小时内可以完全水解鱼皮明胶，而胰蛋白酶和胰酶完全水解鱼皮明胶要两个小时，可能原因是由于菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶是巯基蛋白酶，而胰蛋白酶和胰酶是丝氨酸蛋白酶。而水解后分子量小于700u的短肽显著具有抗氧化活性，可以作为食物中的抗氧化剂加以使用。

2.1.2 动物蛋白酶酶解法 动物蛋白酶一般包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧基肽酶等。陈艳辉［38］等人证明动物蛋白酶作为工具酶对牡蛎蛋白质进行水解，得到了具有抑制肿瘤细胞生长的活性肽，

该水解产物在分子量小于300u时，多肽能明显抑制鼻咽癌CNE－1细胞的生长。陈娅娇［39］用胰蛋白酶水解牛乳蛋白，得到的乳源性抗菌肽提取物对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌都有明显的抗菌活性，但抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌效果要强于大肠埃希氏菌。Ruiz－Giménez［40］等研究胃蛋白酶酶解牛乳铁蛋白得到三段降血压短肽:Arg－Pro－Tyr－Leu、Leu－Ile－Trp－Lys－Leu 和 Leu－Asn－Asn－Ser－Arg－Ala－Pro，均具有 I型血管紧张素转移酶(ACE)依赖的血管收缩抑制作用，数据还表明这三段短肽和分子量低于3ku的牛乳铁蛋白都是有效的降压复合物。

2.1.3 微生物蛋白酶酶解法 微生物蛋白酶的菌种来源有枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉、毛霉等。其中使用比较广泛的Alcalase蛋白酶主要是由枯草杆菌蛋白酶A构成的一种碱性蛋白酶;Flavourzyme风味蛋白酶是由米曲霉发酵产生的，蛋白经过水解后产生一些疏水氨基酸的苦味肽，风味蛋白酶可以把苦味肽降解成氨基酸，从而去除苦味。Wu［41］通过Alcalase蛋白酶水解大豆蛋白，利用超滤和离子交换树脂分离血管紧张素转换酶抑制肽，其在不同的温度和pH下均有活性，表明该抑制肽可以抗消化道蛋白酶的水解。邓靖［42］等研究了曲霉M3蛋白酶水解大豆蛋白，发现水解液的水解度随着水解时间的延长而增大，且在任何水解时间水解液都没有苦味。

2.2 酶解工艺条件优化

酶解法制备短肽的工艺大致是以下流程:物料→水浸泡磨浆或加水溶解→搅拌至充分溶解→调整溶液pH→预加热至酶的适合温度→加蛋白酶酶解→搅拌反应并维持蛋白混合液pH不变→灭酶(沸水或三氯乙酸)→离心过滤→高温杀菌→冷冻干燥、真空浓缩和喷雾干燥→成品。不同的蛋白酶酶解不同的蛋白制备功能性短肽的工艺条件大有不同，但是主要考察的参数有酶解温度、底物浓度、pH、酶解时间、加酶量和料液比等方面。经过单因素实验得到初步工艺条件范围，再利用各种数学计算模型和方法得出最佳的工艺参数。张淑蓉［43］以酸溶性氮得率作为评价指标，用木瓜蛋白酶水解制备南瓜籽仁蛋白多肽，通过正交实验优化酶解条件，酶解液中多肽的酸溶性氮得率为43.52%，抗氧化活性达到Vc的20%以上。潘进权［44］等人探讨了纳豆芽孢杆菌蛋白酶对大豆蛋白的水解作用，确定了最佳酶解条件，大豆蛋白水解度达42.385mg/100g，短肽得率为 66.5%。Pedroche［45］用 Alcalase酶解鹰嘴豆蛋白，经过凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱纯化出四段血管紧张素转换酶抑制肽(ACE－inhibitory peptides)，证明其中两段是ACE竞争性抑制剂，另外两段是非ACE竞争性抑制剂。

3 展望

由于动植物来源的功能性短肽作为一种新型的蛋白质深加工类产品，具有增强人体免疫力、预防和治疗高血压、抗氧化活性、容易消化吸收等功能特性，短肽类作为功能性食品添加剂和药品试剂的应用前景越来越广泛。虽然在制备功能性短肽中还存在着一定的问题，但随着酶解蛋白质技术的发展和新型酶制剂种类的发现，将有助于功能性短肽加工制备的技术升级。我国又是农业大国，蛋白质资源种类丰富，短肽类产品的研制和生产如火如荼，有非常好的应用前景。同时，随着对不同来源的功能性短肽进行深入细致研究，会有更多对人体有益的功能被发掘，将会对食品行业、功能性保健品行业、医药行业的开发壮大有着重要的意义和价值。

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Classification of functional oligopeptides and preparation of enzymatic hydrolysis

LI Hao－jian，YANG Liang－rong*，WEI Xue－tuan，XING Hui－fang，LIU Hui－zhou
(National Key Laboratory of Biochemical Engineering，Key Laboratory of Green Process and Engineering，Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China)

In recent years，the attention focused on nutritional，functional，physiological activities and applied of the functional oligopeptides derived from proteins was increasing.It had a wide variety of sources，functional oligopeptides could be obtained by appropriate enzymatic hydrolysis，with lowering blood pressure，improving immunity，promoting digestion，antioxidant，neural regulation，anti－bacterial and other biological activity.This paper reviewed the sources and classification，discussed the characteristics of oligopeptides in plant protein source and animal protein source，analyzed enzymatic hydrolysis to prepare peptides by selecting the protease and optimization of enzymatic hydrolysis conditions，it might provide the basis for its depth research and development.

functional oligopeptides;classification;enzymatic hydrolysis;preparation

TS201.1

A

1002－0306(2012)17－0373－05

2012－03－14 *通讯联系人

李昊剑(1985－)，男，硕士，研究实习员，研究方向:食品发酵工程。

国家自然科学青年基金(21106162);中国科学院院地合作项目资助。