恩诺沙星化学发光免疫分析试剂盒的研制

刘 邓，丁 飞，侯瑞霞，徐振林，孙远明，杨金易，*

(1.广东省食品质量安全重点实验室，华南农业大学食品学院，广东广州 510642;2.国家肉制品质量监督检验中心(漯河)，河南漯河 462000)

恩诺沙星化学发光免疫分析试剂盒的研制

刘 邓1，丁 飞2，侯瑞霞1，徐振林1，孙远明1，杨金易1，*

(1.广东省食品质量安全重点实验室，华南农业大学食品学院，广东广州 510642;2.国家肉制品质量监督检验中心(漯河)，河南漯河 462000)

主要研制一种基于鲁米诺－辣根过氧化物酶体系的化学发光免疫分析试剂盒，用于检测食品中的痕量恩诺沙星残留。反应条件优化结果为:最佳包被抗原浓度为0.5ng/mL，最佳抗体稀释倍数为1∶2000，药物稀释液为0.01mol/L的PBST溶液，一抗反应时间为30min。研究结果显示:本文研制的试剂盒的回归曲线方程是y=－22842x+172936，检测线性范围是0.024～2.76ng/mL，IC50为0.106ng/mL，对蜂蜜、牛奶、鱼肉和虾肉样本的添加回收率在96%～116%、90%～97%、92%～112%、86%～112%之间，批内和批间变异系数均小于15%，试剂盒在4℃下有效期为180d。

恩诺沙星，化学发光免疫分析，试剂盒

恩诺沙星(Enrofloxacin，ENR)属于第三代氟喹诺酮类(Fluoroquinolones，FQs)药物中的一种，广泛应用于动物和人类多种感染性疾病的治疗［1］。但是，随着恩诺沙星在养殖产业中的广泛应用，其药物残留问题已引起广泛的关注，恩诺沙星在动物源食品中的残留可引起神经中毒、肾功能损伤、过敏反应等毒副作用，并且容易诱使人类致病菌产生耐药性，导致体内环境中耐药性菌株的增加，从而使该类药物在人类疾病的治疗中产生耐药性［2－5］。食品中恩诺沙星残留的检测方法主要分为仪器检测法和免疫分析法两大类。仪器检测法主要包括有高效液相色谱法、液相色谱－质谱联用法等，这些方法对待测样品前处理要求高，操作繁琐，所需仪器昂贵，不适合大批量的筛选检测和现场检测［6－7］。免疫分析法则包括酶联免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和化学发光免疫分析等多种方法。该类方法具有灵敏度高，特异性强，能适应大量样品的快速检测等特点。根据报道，陈雪岚等［8］研制的恩诺沙星酶联免疫分析试剂盒的IC50是10ng/mL，赵莉莉等［9］建立的恩诺沙星时间分辨分析方法的IC50是3.4ng/mL。近年来，随着人们食品安全意识的逐渐增强，人们对有害物质残留的检测要求也越来越高，因此建立灵敏度更高的检测方法成为研究热点之一。化学发光酶联免疫分析法是一种新型的免疫分析方法之一，该方法进行检测时不需要外界光源，减少了背景干扰，可以进一步提高恩诺沙星残留检测的灵敏度，主要用于有害物的痕量和超痕量的检测［10－13］。本文在合成人工抗原及制备多克隆抗体的研究基础上，基于鲁米根过氧化物酶体系(HRP－Luminol－H2O2system)，研制恩诺沙星化学发光免疫分析试剂盒，为恩诺沙星残留检测提供一种新的参考方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

99.5%恩诺沙星 浙江国邦药业有限公司;HRP标记羊抗兔IgG 武汉博士德生物工程有限公司;恩诺沙星－卵清白蛋白偶联物(ENR－OVA)、恩诺沙星多克隆抗体 本实验室提供;恩诺沙星ELISA试剂盒 广州万联生物科技有限公司;乙腈 色谱纯，其他试剂均为国产分析纯。包被缓冲溶液:1.69g Na2CO3，2.95g NaHCO3加去离子水定容至 1000mL;洗涤缓冲液:3.0g Na2HPO4·12H2O，8.0g NaCl，0.6mL Tween－20加蒸馏水定容至1000mL;封闭液:5g脱脂奶粉加去离子水定容至100mL;0.01mol/L PBST溶液:8.5g NaCl，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.9g KH2PO4，0.9g KCl，0.6mL Tween－20，去离子水定容至 1000mL;0.01mol/L的T液:取0.2mol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)与0.2mol/L的 HCl溶液混合，再加入0.1%BSA和0.04%NaN3;CLEIA底物液 A:Luminol－Na 4mg溶于20mL 0.1mol/L的T液中;CLEIA底物液B:2mg对碘酚溶于100μL二甲基亚砜(DMSO)，加入4μL 3%的双氧水(H202);1mg/mL恩诺沙星标准品工作液:称取50mg恩诺沙星标准品，溶于50mL的无水甲醇中。

Wellwash MK2洗板机 美国 Thermo公司;6K－15高速冷冻离心机 德国Sartorius公司;Wallac VITOR31420多标记分析仪 美国PE公司;微量移液器 美国Eppendorf公司;高效液相色谱仪 Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 恩诺沙星icCLEIA检测方法的建立

1.2.1.1 恩诺沙星icCLEIA检测基本步骤 将包被原用包被缓冲液稀释成合适的浓度，100μL/孔加入化学发光板孔中，置于37℃孵育箱中孵育12h，取出化学发光板，用洗板机洗2次，拍干，每孔加入120μL封闭液，置于37℃孵育箱中封闭3h，甩干孔中液体，放置在37℃烘箱中烘1h，备用。

将恩诺沙星标准品工作液稀释为0、0.01、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43、7.29ng/mL 8 个梯度，取50μL 各梯度标准品到包被好的板条中，加入50μL稀释好的抗体，在25℃条件下反应一段时间，用洗板机洗6次。

每孔加入100μL用T液稀释10000倍的酶标二抗，在25℃条件下反应20min，用洗板机洗6次。

然后取等量的化学发光液A与B混合均匀后，将一定量的化学发光液加入到洗好的板条中，反应一定的时间，读数。

1.2.1.2 icCLEIA反应条件的优化 根据以上检测步骤优化icCLEIA免疫反应体系中的包被原浓度、一抗稀释倍数、药物稀释液、免疫反应时间确定免疫反应工作条件;优化发光反应中发光液添加量、发光反应时间确定发光反应工作条件。

1.2.1.3 icCLEIA标准曲线的绘制 以恩诺沙星浓度的对数值lgC为横坐标，各稀释度发光计数RLU为纵坐标，按照RLU－lgC四参数对数拟合绘制恩诺沙星icCLEIA方法的标准曲线。根据标准曲线计算出该方法的半抑制浓度(IC50)和线性范围(IC20～IC80)。

1.2.2 试剂盒组建 根据以上优化条件组建试剂盒，确定试剂盒的组成和检测步骤。

1.2.3 添加回收实验 选取蜂蜜，液态牛奶，鱼肉，虾肉作为添加回收实验样本。其前处理方法如下:

蜂蜜:称取3份样品每份1g置于3个15mL离心管中，分别添加1、5、10ng标准品于样品中，放置10min后分别加入4mL蒸馏水，充分振荡均匀，再加入4mL乙酸乙酯，振荡20min，用离心机以10000r/min的转速离心10min，吸取上层乙酸乙酯层2mL置于鸡心瓶中用旋转蒸发仪旋蒸至干。加入1mL正己烷溶解干燥物，再加入1mL去离子水复溶，去除上层正己烷层，取下层清液50μL待测。

肌肉组织:称取均质后肌肉组织3份，每份各1g置于3个15mL离心管中，分别添加1、5、10ng标准品，静置10min后分别加入4mL去离子水，充分振荡均匀，然后用离心机以10000r/min的转速离心10min，分别吸取上层清液2mL于3个10mL离心管中，加入2mL正己烷，振荡10min，以10000r/min的转速离心10min，除去上层正己烷层，取下层清液50μL待测。

牛奶:吸取牛奶样品3份，每份1g置于3个15mL离心管中，每管牛奶样品分别添加1、5和10ng的恩诺沙星标准品，充分振荡均匀，静置10min。加入6mL乙腈，用去离子水定量到10mL。振荡20min，用离心机以10000r/min的转速离心10min，分别各取上层清液5mL于鸡心瓶中用旋转蒸发仪旋蒸至干，加入1mL正己烷溶解干燥物，再加入1mL去离子水复溶，除去上层正己烷，取下层清液50μL待测。

样本经前处理后，用研制的试剂盒进行测定，根据标准曲线计算出添加的恩诺沙星浓度、添加回收率与变异系数。

1.2.4 试剂盒性能评价

1.2.4.1 精密性实验 以批内变异和批间变异衡量试剂盒的精密度。在添加回收实验中，取同一批次包被板，对同批样品同种样品进行检测，计算批内变异，得到同批样品中同种样品的精密度。对不同批样品中同种样品进行检测，计算批间变异，得到不同批次样品中同种样品的精密度。计算公式为:

1.2.4.2 特异性实验 将恩诺沙星与环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、加替沙星、氯霉素、莱克多巴胺等类似物按相同倍比稀释，按照恩诺沙星icCLEIA检测步骤，在相同条件下分别作分析物及其类似物的竞争抑制曲线，计算其类似物对恩诺沙星多克隆抗体的交叉反应率和IC50。

1.2.4.3 保存期实验 将试剂盒置于4℃环境中，保存6个月，每个月测定一次，置于37℃环境中，保存5d，每天测定一次。分别测定零标准品的发光值B0和50%药物抑制浓度对应的化学发光值B，计算二者的比值B/B0。当B/B0＞0.7时，即可判定试剂盒已失效［14］。在37℃放置1d相当于在4℃放置45d，经过换算可确定CLEIA试剂盒的保存期。

采用Waters高效液相色谱仪，检测条件是:检测器采用紫外检测器，检测波长为280nm，流动相流速为1.0mL/min，进样量设为20μL，柱温为25℃。色谱柱采用Atlantis C18色谱柱(长度160mm×4.6mm，粒径5.0μm)。流动相为:磷酸溶液/三乙胺(0.05mol/L，pH2.4)+乙腈=82+18。

1.2.4.5 HPLC，ELISA，CLEIA三种方法性能对比采用商品化恩诺沙星ELISA试剂盒，参考试剂盒说明书，绘制出恩诺沙星ELISA标准曲线并求出其IC50，比较三种方法的灵敏性。

2 结果与分析

2.1 icCLEIA反应条件的优化

对包被原浓度、一抗稀释倍数、标准品稀释液、一抗反应时间等免疫反应工作条件进行优化(图1a～图1d)，通过比较RLUmax/IC50的值大小(值越大方法的检测效果越好)，确定了icCLEIA最佳免疫反应条件［16］:即包被浓度5ng/mL，抗体稀释倍数为1∶2000，抗体反应时间 30min，标准品稀释液为0.01mol/L PBST溶液;对发光液添加量、添加发光液后到放入发光仪读数之间间隔的时间等发光反应工作条件进行优化(图1e～图1f)，确定发光反应最佳工作条件:发光液添加量为100μL，添加后3～5min之内读数。

2.2 icCLEIA标准曲线的绘制

根据优化的条件按照检测步骤进行检测，每个梯度做5个平行。根据所得的数据，以恩诺沙星浓度的对数值lgC为横坐标，各稀释度发光计数RLU为纵坐标，绘制标准曲线。所得曲线如图2所示。其回归曲线方程为 y=－22842x+172936，R2=0.9912。经计算得该方法检测的线性范围是0.024～2.76ng/mL，IC50是 0.106ng/mL。

2.3 试剂盒的组建

2.3.1 试剂盒组成 试剂盒的组成如表1所示。

[43]Joshua R. Loftus, et al., “Causal Reasoning for Algorithmic Fairness”, May. 15, 2018, https://arxiv.org/abs/1805.05859.

表1 试剂盒的组成Table 1 The composition of the CLEIA kit

2.3.2 检测方法 取出试剂盒，于室温(25℃左右)平衡20min。取出化学发光板，将标准品和样品按每孔50μL依次加入到空白微孔中，做两个平行。在以上各孔中每孔加入50μL的恩诺沙星抗体，放入孵育箱中于37℃下孵育30min。将浓缩洗液稀释100倍，每孔加入220μL，充分洗涤5次，然后用吸水纸拍干。每孔加入100μL的酶标记物，放入孵育箱中于37℃下孵育15min，用洗液洗涤5次，用吸水纸拍干。将化学发光A液和B液等量混匀，每孔加入100μL，加入后3～5min内在化学反光仪上读出各孔的化学发光值。根据标准品各孔的读数绘制标准曲线，根据样品各孔的读数确定恩诺沙星的含量。

图1 不同工作条件对icCLEIA灵敏度的影响Fig.1 Influence of different conditions on sensitivity of icCLEIA

表3 恩诺沙星类似物的交叉反应实验Table 3 Cross－reactivity test of NER analogues

表4 保存期实验Table 4 Storage period of the experiment

图2 ENR的icCLEIA标准曲线(n=5)Fig.2 Standard curve of icCLEIA for ENR(n=5)

2.4 添加回收实验结果

采用上述化学发光方法，对蜂蜜、牛奶、虾肉、鱼肉进行检测，每个添加浓度水平做5个平行，结果显示(见表2):蜂蜜样品的平均回收率为96%～116%，牛奶样品的回收率为90%～97%，虾肉样品的平均回收率为92%～112%，鱼肉样品的回收率为86%～112%。

表2 蜂蜜、牛奶、虾肉、鱼肉样品添加回收实验(n=5)Table 2 Recovery test results with honey，milk，shrimp and fish as samples(n=5)

2.5 精密性实验结果

方法对批内变异和批间变异见表2。由结果得出，批内和批间变异系数均小于15%，对实际样品检测的精密度符合要求。

2.6 特异性实验结果

恩诺沙星结构类似物的交叉反应实验结果如表3所示，由实验结果看出，所用的恩诺沙星抗体特异性好，与环丙沙星和氧氟沙星的交叉反应率分别为1.43%和1.08%，与其他结构类似物和功能类似物的交叉反应率均小于0.1%。

2.7 保存期实验结果

结果如表4所示，在4℃环境中，保存6个月以内，B/B0值均小于0.7，说明试剂保存状态良好。由4℃和37℃实验得出，恩诺沙星试剂盒在4℃状态下至少能保存6个月。

2.8 相关性实验结果

采用HPLC方法，所得的结果为:目标峰形如图3所示，得到恩诺沙星保留时间为13.70min;绘制恩诺沙星标准曲线如图4所示，标准曲线在10～1000ng/mL范围内保持线性关系，回归曲线为y=158000x－216，R2=0.999530。

图3 恩诺沙星标准溶液(500ng/mL)HPLC图Fig.3 The HPLC fig of enrofloxacin standard solution(500ng/mL)

采用HPLC方法，对蜂蜜、牛奶、鱼肉、虾肉进行检测，分别于50、100、250ng/g三个浓度水平做添加回收实验，得出HPLC法添加回收数据。将经过前处理后此三个浓度水平的样品用0.01mol/L的PBST溶液稀释50倍，再用研制的CLEIA试剂盒进行检测，每个浓度做5个平行，得到CLEIA法添加回收实验数据，将实验数据乘以50后与HPLC法实验结果做比较，得出的HPLC和CLEIA相关性如图5所示，由相关性分析得到拟合直线的相关系数R2=0.9961，斜率约为1，说明HPLC与CLIEA检测结果相关性符合要求。

2.9 HPLC，ELISA，CLEIA 性能对比

三种恩诺沙星残留检测方式的性能比较见表7:本文研制的CLEIA试剂盒的IC50最低，灵敏度最好。根据新闻报道，日本在2009年将动物类食品恩诺残留限量标准调整至10ppb，由于一些动物组织如肝脏、贝类等经过前处理后会存在严重的基质效应，要再经过稀释10～20倍进行检测。而经过稀释后样本中恩诺沙星的浓度如果偏离恩诺沙星ELISA试剂盒的检测范围，就会影响恩诺沙星ELISA试剂盒检测的准确度［11］。而本文研制的恩诺沙星CLEIA试剂盒其检测线性范围在0.024～2.76ng/mL之间，可以弥补恩诺沙星ELISA试剂盒的不足，并丰富恩诺沙星残留检测的产品线［8］。

表7 HPLC、ELISA和CLEIA灵敏度对比表Table 7 The sensitivity comparison table between HPLC，ELISA and CLEIA

图4 ENR的HPLC标准曲线Fig.4 Standard curve of HPLC for ENR

图5 HPLC和CLEIA相关性曲线图(n=5)Fig.5 Correlation between HPLC and CLEIA(n=5)

3 结论

本文研制了恩诺沙星的化学发光免疫分析试剂盒，该试剂盒的IC50为0.106ng/mL，线性范围在0.024～2.76ng/mL之间;应用于各样品的添加回收率均落在80%～120%之间，批内变异和批间变异均小于15%;与结构类似物和功能类似物的交叉反应率都小于1.43%;在4℃环境中，能保存180d以上;与HPLC方法进行对比，其线性相关系数R2=0.9961。目前关于恩诺沙星的化学发光免疫分析试剂盒的研制在国内报道很少，本文研制的试剂盒的灵敏度和特异性不仅能够满足目前检测的需求，同时能够满足趋于严格的检测标准，为恩诺沙星残留限量新标准制定提供参考［19－20］。

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Development of an indirect competitive chemiluminescence enzyme immunoassay kit for detecting of enrofloxacin residue

LIU Deng1，DING Fei2，HOU Rui－xia1，XU Zhen－lin1，SUN Yuan－ming1，YANG Jin－yi1，*
(1.Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Provence，Collage of Food Science，
South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China;2.National Meat Products Quality Supervision and Inspection Center(Luohe)，Luohe 462000，China))

A HRP－Luminol－H2O2system based indirect competitive chemiluminescence enzyme immunoassay(CLEIA)kit for determination of enrofloxacin(ENR)residues was developed.The CLEIA conditions were optimized.The optimal concentration of coating antigen was 0.5ng/mL and the antibody dilution was 1∶2000.Using PBST as assay buffer，the incubation time for the primary antibody was 30min.Under the optimal conditions，the standard curve was developed.The regression equation for ENR was y=－22842x+172936 with a linear detection ranging from 0.024 to 2.76ng/mL.The IC50was 0.106ng/mL.The averaged recoveries of ENR from spiked honey，milk，shrimp and fish samples were 96%～116%，90%～97%，92%～112%and 86%～112%，respectively.The coefficient of variation of intra－assay and inter－assay was less than 15%.The developed kit can be stored at 4℃ for 180 days.

enrofloxacin;chemiluminescence enzyme immunoassay;kit

TS207.5

A

1002－0306(2012)17－0325－05

2012－03－06 *通讯联系人

刘邓(1986－)，男，硕士研究生，研究方向:食品质量与安全。

广东省教育部产学研结合项目(2010A090200084，2011A090200029，2009B090300409)。