诺如病毒性胃肠炎快速检测方法的研究

吕 虹 高志勇 张国军 闫惠平 康熙雄*

(1.首都医科大学附属北京天坛医院实验诊断中心，100050;2.北京市疾病预防控制中心传染病与地方病防治所，北京 100013;3.首都医科大学附属北京佑安医院感染与免疫中心，北京 100069)

人类杯状病毒(human caliciviruses，HuCV)包括诺如病毒(norovirus，NVs)和札如病毒(sapovirus，SVs)，是导致人类急性非细菌性胃肠炎的常见病原体，也是仅次于轮状病毒导致儿童急性腹泻的重要病原体。长期以来，由于检测方法的局限，对HuCV给人类造成的危害及其严重程度缺乏正确的认识，常常低估其危害。1992年以美籍学者Jiang X［1］为首的研究组建立并发展了RT-PCR方法检测HuCV后，HuCV所致疾病的危害性和严重性越来越被研究者重视。有效的RT-PCR检测的关键是找到可以用于RT-PCR扩增的保守引物序列，并保证检测的敏感性和特异性，目前，用于HuCV检测的RT-PCR引物序列主要针对RNA多聚酶基因。由于HuCV病毒在粪便标本中的含量较低，需要建立更敏感、更特异的检测方法。同时传统的RT-PCR方法操作繁琐，对实验室和操作人员要求较高，容易引起结果假阳性或假阴性，给疾病诊断带来困难。因此本研究建立了一种检测NVs的新方法，并以传统RT-PCR方法为标准对新方法进行评价，为NVs的检测提供一种快速灵敏的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1)标本来源:选取2007年2月至2007年3月北京市36家医疗机构(二级以上医院和区、市疾病预防控制中心)门诊就诊或住院的腹泻患者364例，其中男性患者 202例，女性患者 162例，男女性别比1.25∶1。患者年龄从 ＜1岁至 79 岁，平均年龄(37.22±19.84)岁。诊断标准依据《诺如病毒感染性腹泻防治方案(试行)》［2］，患者均有腹泻或呕吐等临床症状，每日排便次数≥3次，粪便性状发生明显改变(稀水样、蛋花样、黏液便或稀便等，无脓血)，粪便、血常规检查无特殊发现，显微镜检查排除常见细菌、寄生虫等感染，怀疑病毒性胃肠炎。

2)收集方法:样本采集便盒由北京市疾病预防控制中心统一发放，无菌采便盒外包裹一层可开启的塑料袋。样本均为发病3 d内患者的粪便样本，每份标本量不少于5 mL，不得用肛拭子采集，标本采集后要求立即低温送检，不能及时送检的要求－20℃冰冻保存，标本避免反复冻融。长期保存样本置于－80℃冰箱。

3)试剂来源:恒温快速检测诺如病毒试剂盒由日本东曹公司提供，诺如病毒提取试剂采用美国QIAGEN公司病毒核酸提取试剂盒(QIAamp®Viral RNA Mini Kit)，反转录体系采用Promega公司RNA反转录试剂盒。

4)引物:扩增区域位于诺如病毒基因组ORF1，基因位点在nt 4 568～4 886之间(参考株序列号为M87661)。由北京市中国疾病预防控制中心提供［3］，见表1。

表1 RT-PCR所用引物Tab.1 Primers used in RT-PCR

5)仪器设备:恒温扩增系统由日本东曹公司提供，BIO-RAD扩增仪，Eppendorf高速低温离心机，电泳仪，凝胶成像系统等。

1.2 方法

1)样本处理:粪便样本从－80℃冰箱取出，室温复融。将1 mL样本稀释液(来自DAKO公司诺如病毒ELISA 试剂盒)至1.5 mL Eppendorf管中，加入0.1 g固体粪便样本或0.1 mL液体粪便样本，置于漩涡振荡器上混匀，室温静置10 min，室温下5 500 r/min离心5 min，进行检测。

2)病毒RNA提取:病毒RNA提取采用美国QIAGEN公司病毒提取试剂盒。

3)反转录-聚合酶链反应(RT-PCR):采用 Promega公司RNA反转录试剂盒，反应体系:10×缓冲液2.5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，1%BSA 2.5 μL，0.2 μg/μL 引物 289 混合液 1 μL，10 U/μL AMV-RT 0.35 μL，50 U/μL RNase 0.1 μL，DEPC 处理 H2O 8.05 μL，模板 RNA 1.5 μL，总体积25 μL。轻微离心混匀，42℃反转录1 h。PCR反应体系:10 × 缓冲液 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，0.2 μg/μL 引物 289 混合液 1 μL，0.1 μug/μL 引物 290 混合液 1 μL，5 U/μL Taq酶0.4 μL，DEPC 处理 H2O 29.6 μL，cDNA 8 μL，总反应体积50 μL。轻微离心混匀，放入PCR仪中进行扩增。反应条件:94℃变性3 min，94℃ 1 min，58℃ 80 s，72℃ 1 min，循环30次，最后72℃延伸10 min。扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

4)恒温快速检测方法:将试剂从－20℃冰箱取出，室温复融。分别取10 μL试剂A和10 μL试剂B于0.5 mL PCR扩增管中，再加入5 μL模板RNA，每批次反应加阳性对照和阴性对照。将反应体系放入恒温扩增系统中，43℃预热5 min，同时将混合酶预热3 min，将5 μL酶依次加入反应体系中，进行检测。仪器通过1.3倍阈值判断阴阳性结果。

1.3 统计学方法

用SPSS 11.5统计学软件分析结果，计数资料以百分比表示，采用χ2检验，一致性分析采用Kappa系数，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 应用TRC方法对病毒性胃肠炎患者进行NVs核酸检测的结果

TRC方法检测诺如病毒，可以同时检测NVs GGI型和NVs GGⅡ型，364例病毒性胃肠炎患者粪便样本应用TRC方法进行检测(表2)，NVs GGI型阳性14例，占总检测病例的3.85%(14/364)，阴性350例，占总检测病例的96.15%(350/364);NVs GGⅡ型阳性146例，占总检测病例的40.11%(146/364)，阴性218例，占总检测病例的59.89%(218/364)。

表2 不同型别诺如病毒应用TRC方法检出情况Tab.2 Different types of norovirus detection using TRC method

应用TRC方法对病毒性胃肠炎患者粪便样本进行检测，NVs阳性总数为160例，占总检测病例的43.96%(160/364)。其中 NVs GGI占 8.75%(14/160)，NVs GGⅡ占91.25%(146/160)。

应用TRC方法进行诺如病毒检测，可以通过实时检测荧光检测信号观察结果，检测阳性曲线如图1所示。在146例诺如病毒2型阳性的结果中，阳性结果检出时间显示89.73%的结果小于20 min，在14例诺如病毒1型阳性的结果中，阳性结果检出时间显示78.58%的结果小于20 min。

恒温检测方法共检测出阳性数为160例，检测阳性率为43.96%(160/364)。其中男性患者检出率为45.54%(92/202)，女性患者检出率为 41.76%(68/162)，两组差异无统计学意义(χ2=0.465，P=0.495)。364例腹泻病人样本按年龄分组(表3)，其中阳性率最高的为50岁 ～59岁组，其阳性率为63.63%(35/55)，阳性率最低的为10～19岁组，其阳性率为18.93%(5/26)，通过χ2检验，除10～19岁组检出率低于各组外，其余各组间检验结果差异无统计学意义(χ2=11.704，P=0.069)。

表3 364例腹泻患者NVs检测结果Tab.3 Test results of norovirus determination in 364 sporadic cases of acute viral gastroenteritis

2.2 TRC方法与RT-PCR方法检测病毒性腹泻患者粪便样本中的核酸结果比较

RT-PCR方法检出结果同TRC方法进行比较(表4)，两种方法检测双阳性为139例，双阴性为191例，另外有34份样本两种方法检测结果不一致，其中TRC检测方法阳性但是RT-PCR检测方法结果阴性有21份，用RT-PCR方法检测阳性而TRC方法检测阴性的为13份。

以RT-PCR为标准，计算TRC方法的敏感度、特异性等指标如下:

敏感度Se=a/(a+c)=139/(139+13)=91.45%;

图1 诺如病毒检测阳性曲线Fig.1 Positive curve for detection of norovirus NVs:norovirus.

表4 TRC方法与RT-PCR方法的检测结果Tab.4 Test results of TRC and RT-PCR

特异度Sp=d/(b+d)=191/(21+191)=90.09%;

总的符合率π=(a+d)/(a+b+c+d)=(139+191)/(139+21+13+191)=90.66%;

比数积OP=Se/(1－Se)*Sp/(1－Sp)=ad/bc=139*191/21*13=97.25;

阳性预测值PV+=a/(a+b)=139/(139+21)=86.88%;

阴性预测值PV－=d/(c+d)=191/(13+191)=93.63%。

这两组检验结果经过配对χ2检验，P=0.229，说明两组阳性检出率之间的差异无统计学意义，即两种实验方法结果无差异。通过一致性检验结果显示Kappa=0.809，P=0.000，可见这两种试验方法结果一致性极佳。

3 讨论

NVs属于HuCV科中诺如病毒属，病毒直径约为26～35 nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称;NVs基因组是单股正链RNA，全长约7 642 nt。诺如病毒家族成员庞杂，目前已对其100多个分离株进行基因测序。核酸的同源性分析表明，世界不同地区、不同时间流行的诺如病毒基因RNA多聚酶区序列相对保守，核苷酸氨基酸序列同源性高于60%，有的达到90%以上。因此，根据 RNA多聚酶区核苷酸序列的相似性，将诺如病毒分为5个遗传组(genogroups，GG)，其中感染人的包括 GGⅠ、Ⅱ和Ⅳ。GGⅠ组也可感染猪，GGⅢ和GGⅤ组分别感染牛和鼠。NVs除了分5个遗传组外还分29个基因型，其中GGⅠ组有8个，GGⅡ组有17个，GGⅢ组2个，GGⅣ组有1个，GGⅤ组有1个。其中GGⅡ/4型是传播最广的基因型，中国以及世界上绝大多数胃肠炎的暴发疫情都是由GGⅡ/4型引起的［4-6］。由于NVs不能进行体外培养，也没有合适的动物模型，因此对其研究受到制约，检测方法的进展研究缓慢。目前用于检测该病毒的方法主要有电镜法、免疫学检测和分子检测等，这些检测方法是分别基于病毒外形特点、主要抗原决定簇和特异性核酸序列而建立的。1972年美国科学家Kapikian A Z等［7］就是通过免疫电镜的方法发现NVs，因此该方法在很长一段时间内成为检测NVs的经典方法。此方法对操作者的技能和经验要求很高，没有得到广泛的推广。RT-PCR方法特异性好、灵敏度高，能检测到10～40拷贝的病毒核酸。20世纪90年代以来，研究者们分别成功地运用RT-PCR的方法对感染者粪样中的NVs核酸进行了检测，设计引物对RNA多聚酶基因相对保守的区域进行扩增，获得了较高的阳性率。直至今日，RT-PCR方法仍是检测NVs的常用方法。本研究中RT-PCR方法所用引物为针对HuCV RNA多聚酶区而设计的P289/P290混合引物，此方法检出率高［8-11］，对于NVs的扩增产物为319 bp，SVs的扩增产物为331 bp，2者由于片段大小接近，很难用琼脂糖凝胶电泳区分，需通过测序分析鉴定。

本研究所采用的TRC方法是一种带荧光标记的实时监控恒温扩增方法，引物设计位于 ORF1和ORF2的交界区。在43℃条件下，利用INAF荧光探针对目标RNA进行实时监测。应用TRC方法检测病毒性胃肠炎患者粪便样本中NVs核酸检出率为43.96%(160/364)，略高于 RT-PCR 方法(41.76%)。以RT-PCR方法为标准，TRC方法，敏感度91.45%，特异度90.09%，总的符合率为90.66%，阳性预测值86.88%，阴性预测值93.63%。通过配对 χ2检验和Kappa检验，两种方法结果之间差异无统计学，一致性极佳。

此外，TRC方法可以同时检测NVs GGI和NVs GGⅡ，无需经过克隆测序分型，快速、简便、灵敏、经济，适合临床和疾控部门推广使用。

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