Rpe65在2型糖尿病模型大鼠视网膜病变中的表达研究

谢 胜 梅 妍

（昆明医学院附属昆华医院，云南省第一人民医院，昆明 650032）

糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见最严重的慢性并发症之一，极具视力威胁。DR 是一种多因素的复杂疾病，其发病机制经过多年的研究尚未完全明确，近年研究发现光感受器功能相关基因在糖尿病视网膜病变过程中有所表达，其中色素上皮细胞特异蛋白65（Retina pigment epithelia－specific protein 65，RPE65）突变可导致视网膜中视紫红质含量降低，相当于视网膜长时间处于暗环境中［1－4］，从而造成光感受器细胞不能对光发生反应，到疾病晚期发生视锥和视杆细胞变性导致严重的视力丧失。实验研究发现Rpe65 敲除小鼠在生后2～3周即可出现视锥细胞变性，且随着年龄的增加视杆细胞也逐渐发生变性［5］。这种视网膜光损伤的易感性是由基因决定的，而Rpe65在其中起重要作用［6］。我们采用实时荧光定量多聚酶链反应（RT－PCR）技术，初步分析Rpe65在不同病程糖尿病大鼠视网膜组织上的表达量。

1 材料与方法

1.1 糖尿病动物模型

SD 大鼠32只，雌性，体重：56～460g（昆明医学院动物中心提供）。SPF 级GK2 型糖尿病大鼠32只，雌性，体重：98～442g（上海斯莱克实验动物中心提供）。动物按标准试验动物要求饲养。按糖尿病病程分为四组，即糖尿病4w 组、8w 组、16w组、24w 组，每组8只。对照组与实验组周龄相对应分组，每组8只。

1.2 视网膜总RNA提取及纯度检测

取对照组和实验组各32只大鼠，血糖值范围分别为5.2～6.7mmol／L（均值5.8mmol／L）和11.8～22.3mmol／L（均值17.9 mmol／L）。3%戊巴比妥按2ml／kg体重腹腔注射深麻醉后取视网膜。用TRIZOL试剂盒，按说明书进行操作提取总RNA。4%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测结果显示RNA 含量及纯度达到试验要求。

1.3 RT－PCR

分别取正常组、实验组样本总RNA 各1ml，设计引物序列Rpe65F和Rpe65R 分别为5′－actgtcctcaccactaac－3′和5′－aggctcagatccaacttc－3′（分子量为106BP），GAPDHF 和GAPDHR 分别为5′－gtgacttcaacagcaactc－3′和5′－gtccagggtttcttactcc－3′，由上海生工公司合成引物。由此逆转录生成cDNA，并进行RT－PCR测定。扩增反应完毕后根据融解曲线分析PCR 产物的特异性，由Light Cycler PCR 仪分析其Ct值，并与标准曲线比较得到定量结果。采用相对双Delta Ct法（DDCT／2－ΔΔCT）进行结果分析，公式：2－ΔΔCT。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析。数据以均数±标准差表示，实验组和对照组测量指标的比较采用独立样本t检验或配对样本的t检验。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

Rpe65和GAPDH 溶解曲线呈单一峰值，特异性较好，结果可靠；Rpe65和GAPDH 扩增曲线呈S型，扩增效果良好。实验组与对照组间的平均Ct值具有统计学意义（见表1）。结果表明：RT－PCR 检测视网膜内Rpe65的表达，与对照组相比，实验组糖尿病大鼠视网膜中Rpe65 的表达随周龄的增加呈下降趋势，即4W＞8W＞16W＞24W。

表1 对照组和实验组各周龄大鼠的Rpe6表达的定量PCR结果Table 1 The level of Rpe6expression of different aged rats in control and experiment groups

3 讨论

Rpe65由Hamel等于1993 年发现，定位于染色体1p31，是视网膜色素上皮细胞特异性表达、高度保守的蛋白序列。在视网膜色素上皮细胞中大量特异性表达，尤其以视网膜色素上皮细胞微粒体膜表达为主。其含有14 个外显子，编码533 个氨基酸，分子量为65KD，被认为是催化全－反－视黄酯转变成11－顺－视黄醇的异构酶之一，后者再经过一系列代谢转变成视紫红质，参与光信号的传导过程［7］。

通常认为糖尿病视网膜病变主要是视网膜微血管病变。然而，越来越多的证据表明，糖尿病视网膜病变出现微血管病变以前，神经视网膜已有病变改变，即视功能损害早于微血管病变发生。研究显示，早期糖尿病患者视网膜神经节细胞和双极细胞功能就已有异常改变［8］。在眼底血管出现荧光造影异常前就表现出视觉电生理、色觉和视野检查的异常［9－10］。Kirwin等［11］应用PCR和免疫组化实验技术显示，Rpe65在糖尿病4周时表达降低，并随病程持续下降至3个月后，证明在糖尿病早期，神经胶质和神经元功能障碍已导致视觉损害。梅妍等［12］实验结果提示，糖尿病早期，代谢的异常已经对视网膜光感受器的功能产生了影响。光感受器功能相关基因的表达异常有可能是糖尿病早期微血管病变发生前视力下降、色觉丧失、对比敏感度降低和视网膜电流图异常的重要原因。电生理研究提示，早期糖尿病患者视网膜神经节细胞功能就已有异常改变。形态学研究究也提示，神经视网膜变性先于微血管损害发生［13－14］。

本实验通过检测2 型糖尿病大鼠不同病程中Rpe65的表达量，探讨其在2型糖尿病视网膜病变过程中的作用。结果显示：与正常对照组相比，糖尿病组各期Rpe65表达下降，且随着病程的延长，表达逐渐降低。表明Rpe65 表达变化与DR 发生有关，其在视网膜上的表达水平与2型糖尿病模型大鼠的病程呈负相关性。提示糖尿病影响了Rpe65在糖尿病大鼠视网膜上的表达，这种表达的改变可能参与了糖尿视网膜病变的发生，并且这种表达的改变有可能是糖尿病视网膜病变发生发展的促进因素之一，对糖尿病视网膜病变并非仅是微血管病变的观点起到了一些支持作用，也为进一步探索预防早期糖尿病视网膜病变的进展和开辟治疗糖尿病视网膜病变的新途径提供了一些新的线索。

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