大肠癌中17号染色体异倍体与p53表达改变的相关性研究

张 旭 曹译心 张翠薇 伍 洋

1（泸州医学院 病理教研室，泸州646000）

2（泸州医学院 组胚教研室，泸州646000）

3（泸州医学院 附属医院 急诊科，泸州646000）

大肠癌的发生发展是多种因素共同作用的结果，包括外界环境，自身因素，抑癌基因或癌基因的缺失、突变、激活及染色体数目和结构的异常改变等。p53 是重要的抑癌基因，p53 基因突变与肿瘤发生发展及患者的预后有关，p53 定位于染色体17p13.1，因此17号染色体的改变也受到越来越多的重视。本研究采用荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）技术检测17号染色体的改变，并对其17号染色体位点存在的P53蛋白表达进行检测，希望能够找出二者之间的相关性，并为大肠癌的预后提供一定的帮助。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集泸州医学院附属医院2012年大肠癌标本67例，所有病例均经术后病理诊断为大肠癌，均为腺癌。其中男性37例，女性30例，中位年龄55岁，其它病理参数见表1。所有病例均为石蜡包埋，4 μm 厚切片。

1.2 FISH 检测

17号（Spectrum red）染色体着丝粒探针，购自美国Vysis公司。4μm 厚石蜡切片一张用于17号染色体FISH 分析。实验步骤如下：常规脱蜡水化，置于梯度酒精脱水，50℃水浴下30%酸性亚硫酸钠预处理30分钟，2×SSC（氯化钠、柠檬酸钠缓冲液）洗涤2 次，37 ℃蛋白酶K 消化10 分钟，依次经70%、85%、100%酒精各脱水2分钟，自然干燥。取10μl探针混合液滴于玻片，加盖玻片，橡胶水泥封片，放入原位杂交仪，37 ℃过夜，杂交后2×SSC 洗涤，暗处自然干燥，滴加二咪基苯基吲哚（DAPI）显色液，盖玻片封片，荧光显微镜观察结果。

1.3 免疫组织化学染色

采用EnVision法，p53单克隆抗体及EnVision试剂盒均购自北京中杉生物工程有限公司。实验步骤按说明书进行。

1.4 结果判读标准

FISH 检测结果判定：低倍选定肿瘤区域，高倍镜下随机计数50个细胞，不计数重叠细胞，细胞核内出现红色信号即为17号染色体倍体情况，细胞核内红色信号≥3个视为多倍体，＜2个信号视为单倍体。

免疫组化判断标准：p53以细胞核呈现棕黄色颗粒为阳性，阳性细胞数＞10%为阳性，＜10%为阴性。

1.5 统计学分析

采用χ2检验，所有数据采用SPSS 11.5统计软件，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 17号染色体异倍体和P53蛋白在肠癌中的表达与临床病理参数的关系

癌组织中17号染色体异倍体31例，其中多倍体29例，单倍体2例（见图1A，B），以多倍体为主。17号染色体异倍体与患者年龄、性别，肿瘤分化程度及淋巴结转移均无关（P＞0.05），只与Dukes分期有关（P＜0.05），17号染色体异倍体在高中低分化癌中的发生率分别为62.5%（10／16），42.9%（12／28），39.1%（9／23）（见表1）。

p53在67例癌组织中的阳性表达率为55.2%（37／67，见图2A，B），与临床病理参数比较，其阳性表达与Dukes分期及淋巴结转移有关（P＜0.05），而与其他临床各参数之间比较显著性差别（P＞0.05），p53在高中低分化癌中的阳性率分别为56.3%（9／16），60.7%（17／28），47.8%（11／23）（见表1）。

表1 17号染色体异倍体与P53蛋白表达与临床病理参数的关系Table 1 Chromosome 17aneuploidy and P53protein expression with clinicopathological parameters

2.2 大肠癌中17号染色体异倍体与p53蛋白表达之间的相关性

17号染色体发现有31例异倍体，其中有14例与p53蛋白阳性表达例数相同，经相关性分析显示，二者之间无显著相关性（P＝0.124）（见表2）。

表2 17号染色体多倍体与P53蛋白表达的相关性Table 2 Correlation of chromosomes 17and P53protein expression

3 讨论

肿瘤的发生发展归根到底是遗传学的变化，其中主要是遗传物质的改变，包括染色体数目结构的异常，染色体的数目异常表现多样，常见有单倍体，三倍体，四倍体及以上等异倍体现象。检测这些染色体的异常多数集中于恶性肿瘤，在大肠癌中，同样存在染色体数目的异常情况，本研究采用FISH 技术检测17号染色体着丝粒在大肠癌中的情况，结果发现，17号染色体在67例大肠癌中有31例发生异倍体，其中多倍体29例，单倍体2例，因此可知大肠癌中17 号染色体异常多数是多倍体状态。有学者［1］对胃癌中的17号染色体的改变进行了研究，结果发现胃癌中同样存在17号染色体多倍体增多的现象，99例中有56例为多倍体，2例为单倍体，与本研究结果基本相似。

早期已有报道［2］，17号染色体断臂丢失是晚期大肠癌的标记，是患者预后不良的指标。本研究检测17号染色体着丝粒的改变，17号染色体改变与临床病理参数比较发现，与患者的年龄、性别及肿瘤的分化程度及淋巴结有无转移均无关，而与Dukes分期有关，我们在比较过程中，反复比对，结果仍然一致，我们分析认为，在大肠癌中，17号染色体异倍体贯穿于癌的发生发展全过程中，可能与患者的预后无关。本结论与早期研究结果不一致，是否与研究例数有关还有待进一步验证。在膀胱癌中研究发现，随着分级的升高，17号染色体多倍体改变显著增加，17 号染色体畸变与膀胱癌的分级呈正相关［3，4］。但本研究统计学分析显示大肠癌中17号染色体改变与肿瘤分化程度无关，因此我们认为在大肠癌中17号染色体的改变只与大肠癌的发生发展有关而与患者的预后无关。虽然未发现有统计学意义，但是可以看出，17号染色体异倍体在高中低分化癌中的发生率依次降低，17号染色体在分化高的肿瘤中发生异倍体的频率较高，这可能提示17号染色体异倍体与肿瘤的早期发生有关。

众所周知，p53是重要的抑癌基因，在多种肿瘤中均表达增高，p53发生基因突变后，失去了控制细胞生长及DNA 修复的作用，使染色体异常改变随着传代不断遗传，最终导致细胞发生恶变，形成肿瘤［5］。本研究发现p53在大肠癌中的阳性表达率为55.2%，稍高于单宝珍等［6］研究结果（48.5%），而低于赵光明等［7］研究结果（66.7%）。我们还发现，p53表达与患者年龄、性别及分化程度无关，但有文献报道［8，9］，30例大肠癌中，p53表达与分化程度有关，这可能与研究例数有关。我们的实验显示p53表达只与Dukes分期及淋巴结转移有关，随着Dukes分期的增加，p53阳性表达例数增加，发生淋巴结转移的病例阳性例数明显高于未发生转移的病例，表明p53阳性表达可能与患者的预后相关，是患者预后差的标记，这与眭怡群等［5］研究结果一致，因此我们提示未发生淋巴结转移的35例中8例阳性的患者应该引起注意，加强随访。

p53是位于17号染色体短臂上的基因，突变型p53的表达是肿瘤发生发展的重要原因［10］，因此17号染色体的改变与肿瘤的发生发展相关，王权等［11］人应用微卫星杂合性缺失的方法发现胃癌中17号染色体可能存在3个与胃癌相关的基因，而p53可能是其中之一，但该研究还需要其他实验进一步证实。本研究采用FISH 方法检测17号染色体着丝粒的改变，结果发现其异倍体的发生率与p53阳性表达率无关，该结果虽然与在乳腺癌中的研究结果［12］相似，但是我们分析认为由于p53 是位于17号染色体上的基因，那么二者之间一定有某种联系，这可能与研究方法和例数有关，也可能是17号染色体还存在其他的与p53相似的基因但尚未发现。

［1］鲁海珍，吴玉鹏，罗巍，等.胃癌17 号染色体异倍体改变及TP53和拓扑异构酶IIα 蛋白过表达与病理诊断的相关性［J］.中华肿瘤杂志，2009，31（10）：754－758.

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［5］眭怡群，冯一中.自噬相关基因LC3、Beclin－1与凋亡相关基因p53、BCL－2在大肠癌中的表达及意义［J］.临床与实验病理学杂志，2012，28（3）：282－286.

［6］单宝珍，童强，李梅，等.大肠癌发生中突变型P53与hMLHl表达的关系［J］.大连医科大学学报，2009，31（3）：270－273.

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