卷枝毛霉发酵产壳聚糖酶的条件优化

何灏彦

（湖南化工职业技术学院化工系，湖南 株洲412004）

壳聚糖是甲壳素脱乙酰基后的产物，是一种天然的阳离子型直链氨基生物多糖。壳聚糖具有生物相容性，无毒，无过敏反应，但通常分子量很大、只能溶于某些酸性溶液中，使得它的应用受到很大的限制，甚至其某些特殊功能只有在降解成壳寡糖后才能表现出来。壳聚糖的降解方法主要包括化学法、物理法、酶解法[1］，其中，酶解法具有能耗低、原料价廉、环境污染小、反应条件温和、易控制、设备简单、产品生物活性高等优点，具有广阔的应用前景[2］。

壳聚糖酶是一种对线性壳聚糖具有分解作用的专一性酶，可以选择性地、特异性地切断壳聚糖的β－1，4－糖苷键，得到特定分子量范围的壳寡糖[3］。作者在此以壳聚糖为诱导物，诱导卷枝毛霉产生壳聚糖酶，并对产酶条件进行了优化。

1 实验

1.1 试剂

pH 值为7.2的 Tris－HCl缓冲溶液：50.0mL 0.1mol·L－1Tris＋44.7mL 0.1mol·L－1HCl。

DNS（3，5－二硝基水杨酸）试剂：3，5－二硝基水杨酸1%、苯酚0.2%、亚硫酸钠0.05%、氢氧化钠1%、酒石酸钾钠20%，贮存于棕色瓶中，一周后稳定。

1.2 培养基

PDA斜面培养基：称取马铃薯200g，去皮，切块，煮沸0.5h后用纱布过滤，加20g葡萄糖、20g琼脂，溶化后补水至1000mL，121℃灭菌20min。

葡萄糖－硫酸铵培养基：葡萄糖2%，KH2PO40.1%，（NH4）2SO40.5%，不同质量（0.0g，0.2g，0.4g，0.6g，0.8g，1.0g）的脱乙酰度为99%的壳聚糖，自来水1000mL。分装后，121℃灭菌20min。

1.3 卷枝毛霉的培养及壳聚糖酶的分离纯化

在含一定浓度壳聚糖的葡萄糖－硫酸铵液体培养基中，将卷枝毛霉于一定温度、一定pH值、一定转速下摇床培养一定时间；将10L培养基通过砂芯漏斗过滤，得到菌丝体；将其置于研钵中，用玻璃粉研磨1h，然后用pH 值为7.2的20mmol·L－1Tris－HCl缓冲溶液稀释；最后于2500×g离心20min，取上清，即得含有壳聚糖酶的粗酶液。

纯化：将粗酶液离心（20 000×g），取200mL上清液，加入固体硫酸铵达到60%至饱和；再离心（20 000×g）15min，取上清液，加入固体硫酸铵达到80%至饱和；再离心，取沉淀溶解于5mmol·L－1醋酸钠缓冲溶液（pH值5.3）中，并透析1次；然后上20mL二乙胺乙基纤维素柱，用pH值为5.5的醋酸钠缓冲溶液以5～100mmol·L－1梯度洗脱，流速60mL·h－1，得到的酶稀释液大约是50mmol·L－1的醋酸钠，通过胶棉过滤浓缩到1mL；再用pH值为7.2的20mmol·L－1氯化三羟甲基甲烷缓冲溶液透析；然后上3mL二乙胺乙基纤维素柱，先用上述相同浓度的醋酸钠缓冲溶液洗脱（流速12mL·h－1），再依次用40 mL氯化钠溶液（0～0.3mol·L－1）、15mL 0.3mol·L－1氯化钠溶液、30mL 0.45mol·L－1氯化钠溶液梯度洗脱（洗脱剂均配有pH值为7.2的20 mmol·L－1Tris－HCl缓冲溶液），即得到纯化的壳聚糖酶液。

1.4 产酶条件的优化

在不同的壳聚糖浓度、培养温度、培养基pH值、培养时间和摇床转速下对卷枝毛霉的产酶能力进行比较，以确定卷枝毛霉发酵产壳聚糖酶的最佳条件[4］。

1.5 壳聚糖酶活力的测定方法

首先，按DNS比色法，以葡萄糖浓度（x）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标绘制标准曲线，然后用最小二乘法进行线性回归，得拟合回归方程：y＝0.2604x－0.0441，相关系数R＝0.9953，表明葡萄糖浓度与吸光度线性关系良好。

然后，用DNS法进行酶活力测定（以蒸馏水的DNS反应液为参照）：取壳聚糖酶液2mL，与2mL质量分数为1%的壳聚糖溶液混合，50℃下保温30min；再用质量分数为1%的NaOH溶液调pH值大于8.0，将未被降解的壳聚糖沉淀出来，于3000r·min－1离心10min；取上清液1mL，用DNS法测定吸光度，再根据回归方程计算还原糖浓度，表征培养液中酶的活力[5］。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖浓度对卷枝毛霉产酶能力的影响

固定培养温度为35℃、培养基pH值为5、培养时间为80h、摇床转速为180r·min－1，考察壳聚糖浓度对卷枝毛霉产酶能力的影响，结果见图1。

图1 壳聚糖浓度对产酶能力的影响Fig.1 Effect of chitosan concentration on enzyme production capacity

由图1可知，卷枝毛霉的产酶能力随壳聚糖浓度的增大先升高后降低，在壳聚糖浓度为0.8g·L－1时，产酶能力最高。这是因为，壳聚糖浓度增大，对卷枝毛霉产酶的诱导作用相应增强，起到了对卷枝毛霉的驯化作用，从而提高了卷枝毛霉的产酶能力；当壳聚糖浓度增大到一定程度后，由于溶液的粘度增大影响到培养液的溶氧效果，微生物代谢率降低，卷枝毛霉的产酶能力相应下降；而且壳聚糖是一种抑菌物质，浓度越高，对微生物的抑制作用越强，这也会影响微生物的生长和产酶[6］。因此，选择最佳壳聚糖浓度为0.8g·L－1。

2.2 培养温度对卷枝毛霉产酶能力的影响

培养温度对产酶能力有着双重影响，一方面，升高温度可以提高卷枝毛霉的产酶速率，但随着温度的升高，酶会逐渐地变性失活。固定壳聚糖浓度为0.8g·L－1、培养基pH值为5、培养时间为80h、摇床转速为180r·min－1，考察培养温度对卷枝毛霉产酶能力的影响，结果见图2。

图2 培养温度对产酶能力的影响Fig.2 Effect of culture temperature on enzyme production capacity

由图2可知，卷枝毛霉的产酶能力随着培养温度的升高先升高后降低，在培养温度为40℃时，产酶能力最高。因此，选择最佳培养温度为40℃。

2.3 培养基pH值对卷枝毛霉产酶能力的影响

固定壳聚糖浓度为0.8g·L－1、培养温度为40℃、培养时间为80h、摇床转速为180r·min－1，考察培养基pH值对卷枝毛霉产酶能力的影响，结果见图3。

图3 培养基pH值对产酶能力的影响Fig.3 Effect of pH value of culture medium on enzyme production capacity

由图3可知，卷枝毛霉的产酶能力随培养基pH值的增大先升高后降低，在培养基pH值为5.5时，产酶能力最高。这是因为，壳聚糖的溶解度与pH值有很大关系，壳聚糖只能在酸性溶液中溶解，在pH值为7.5时则完全不溶，即pH值过高时，卷枝毛霉很难利用沉淀的壳聚糖，其生长及产酶都受到抑制；但pH值过低对卷枝毛霉的生长不利，培养液的生物量低，导致酶活降低[7］。因此，选择最佳培养基pH值为5.5。

2.4 培养时间对卷枝毛霉产酶能力的影响

固定壳聚糖浓度为0.8g·L－1、培养温度为40℃、培养基pH值为5.5、摇床转速为180r·min－1，考察培养时间对卷枝毛霉产酶能力的影响，结果见图4。

图4 培养时间对产酶能力的影响Fig.4 Effect of culture time on enzyme production capacity

由图4可知，培养时间为84h时，卷枝毛霉的产酶能力最高。因此，选择最佳培养时间为84h。

2.5 摇床转速对卷枝毛霉产酶能力的影响

固定壳聚糖浓度为0.8g·L－1、培养温度为40℃、培养基pH值为5.5、培养时间为84h，考察摇床转速对卷枝毛霉产酶能力的影响，结果见图5。

由图5可知，卷枝毛霉的产酶能力随摇床转速的加快先升高后降低，在摇床转速为180r·min－1时，产酶能力最高。这是因为，摇床转速能影响培养液的溶氧效果，从而影响卷枝毛霉的产酶能力，但过量的溶氧对菌株合成酶不利[8］。因此，选择最佳摇床转速为180r·min－1。

图5 摇床转速对产酶能力的影响Fig.5 Effect of rotation speed on enzyme production capacity

3 结论

以壳聚糖为诱导物，诱导卷枝毛霉产壳聚糖酶的最佳条件为：诱导物壳聚糖浓度0.8g·L－1、培养温度40℃、培养基pH值5.5、培养时间84h、摇床转速180r·min－1。

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