牛奶和婴儿配方奶粉中三聚氰胺筛选和定量方法的验证及测定效果（一）

文 / Petra Lutter Marie Claude Savoy Perroud 等

季 昀 庞学燕 译 扬州大学动物科学与技术学院

1 引言

三聚氰胺，化学名为2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪，被用于大批量生产制造积层塑胶板、塑料涂膜、商业滤器、胶水或粘合剂以及一些餐具和厨房用品的三聚氰胺甲醛树脂（Bradley，Boughtfower，Smith，Speck，Castle，2005；Lund，Petersen，2006；Martin，Hizo，Ong，Alba，Ishiwata，1992）。2007年，有人为了提高食品中的蛋白质含量测定值，故意将三聚氰胺添加到谷朊粉或其它以谷物为原料的成分中，制作宠物食物。由于三聚氰胺是一种廉价，且在全世界范围都很容易得到的化学药品，因此其受到了很多不法分子的利用。有文献已经报道了一些宠物食品中三聚氰胺的检测方法（Heller，Nochetto，2008；Kimetal，2008；Muniz Valencia et al，2008；Vail，Jones，Sparkman，2007）。近年来，在中国发生的“婴幼儿奶粉事件”对婴儿的健康产生了严重的不利影响（WHO/FAO，2008），因此进一步加强对牛奶供应链和成品的合理控制已经成为必需。

食品中添加三聚氰胺所带来的危害，不仅是因为掺假，还有许多不同原因也可导致食品受三聚氰胺的污染。这些原因从环丙氨嗪（杀虫剂）的分解（Patakioutas，Savvas，Matakoulis，Sakellarides， Albanis，2007；Yokley，Mayer，Rezaaiyan，Manuli，Cheung，2000）到经过检验的食品包装材料的转移（欧盟指令2002/72/EC）。近来，倍受关注的是牛奶中三聚氰胺的检出，其原因可能是用作动物饲料的成分污染了三聚氰胺导致的（Cruywagen，Stander，Adonis，Calitz，2009）。有试验结果表明，给奶牛饲喂含0.015%（w/w）的三聚氰胺的浓缩颗粒料将显著提高牛乳中三聚氰胺的浓度，奶牛吸收被三聚氰胺污染的饲料5 h后，乳中三聚氰胺浓度达到15 mg/kg。根据这项研究，估计饲料中约2%的三聚氰胺转移到了乳中。因而急需能够检测和定量乳中三聚氰胺的方法，以确保乳制品，尤其是婴儿奶粉的安全性。

本试验描述了与牛乳（CM）及以牛奶为原料的婴儿配方奶粉（MBPIF）中三聚氰胺的检测有关的2 种筛选方法和2 种定量方法。筛选方法是酶联免疫吸附测定（ELISA）和液相色谱法联合紫外线检测（HPLC-UV），而定量方法则是基于质谱分析技术的。简单而经济的ELISA对于控制CM中潜在的掺假是一个有用的工具，而液相色谱法联合紫外线检测（HPLC-UV）适用于检测产品的质量，因为这种技术能够获得精确的定量数据。鉴定分析是基于气相色谱质谱联用（GC-MS）以及液相层析串联质谱（LC-MS/MS），这些源于质谱分析法的分析技术之所以被作为定量方法是因为这种检测方式为被测物质的化学结构提供了信息。本文报道了4 种方法的效果和测定数据，并讨论了以国内和欧洲的测定效果为体系得到的结果。

2 材料与方法

2.1 化学试剂

三聚氰胺（2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪）、三聚氰酸、辛基磺酸、嘧啶99%、青霉素G，购自Sigmae-Aldrich公司（布克斯，瑞士）；标记同位素的同系物（13C3，15N3）三聚氰胺（同位素纯度：13C3，99%；氨基-15N3，98%，化学纯度≥98%），由剑桥同位素实验室提供（安得沃，MA，美国）；标准品、三聚氰胺一酰胺、环丙氨嗪，购自Dr Ehrenstorfer公司（奥格斯堡，德国）；醋酸铵、氨水（5%）、浓甲酸（98%～100%）、LiChrosolv乙腈、LiChrosolv甲醇、LiChrosolv水、ZnSO4·7H2O、Lichrolut强阳离子交换SCX固相萃取小柱，购自Merck公司（达姆施塔特，德国）；K4Fe（CN）6·3H2O、氯霉素、磺胺甲嘧啶，购自Riedel-de-Haen（塞尔策，德国）；三聚氰胺酶联免疫试剂盒，购自Abraxis（沃明斯特，美国宾夕法尼亚州）；环丙沙星，购自Fluka；OASIS MCX 6 cc/500 mg SPE小柱，购自Waters（Waters S.A.S.，Saint-Quentin En Yve- lines，法国），作为衍生剂的BSTFA-TMCS（99+1），购自Supelco。

2.2 食品样本

实验室样本是CM或以CM为原料的MBPIF。CM源自当地制酪厂，使用前4 ℃保存。新鲜牛乳的实验室样本在取实验用量之前要再次混匀以防油脂相和水相分离。MBPIF取自一些当地的超市，为保证均质化，每包奶粉全部转移到容量为实验室样本容量2 倍的样本容器中，容器反复摇晃和颠倒。

2.3 ELISA

2.3.1 样本的前处理

三聚氰胺酶联免疫试剂盒可在室温操作。漂洗缓冲液用蒸馏水（850 mL）稀释5 倍。样本稀释缓冲液是PBS/甲醇（10%）溶液，它是用蒸馏水溶解NaH2PO4·H2O（0.49 g）、Na2HPO4（2.05 g）和NaCl（16.2 g）制成，可选择性用NaOH（1 M）或HCl（1 M）调节pH值至7.0～7.4，然后加100 mL甲醇，用蒸馏水定容至1 000 mL。Carrez I溶液是用200 mL蒸馏水溶解7.2 g K4Fe（CN）6·3H2O制成。Carrez II溶液是用200 mL蒸馏水溶解14.4 g ZnSO4·7H2O制成。准备好三聚氰胺HRP酶交联底物终止液和用于校正的标准溶液以及三聚氰胺定量检测试剂盒（Abraxis）。稀释缓冲液浓度按照试剂盒制造商的描述制备。试验使用三聚氰胺标准储备溶液（0.2 mg/mL），通过稀释三聚氰胺储备溶液来测定回收率。

CM分析之前不进行进一步处理。MBPIF取1 g溶于8 mL样品稀释缓冲液中，漩涡处理10 s，在机械摇动器上剧烈摇动10 min。1 mL每份的CM或MBPIF转入微量离心管。空白样品加入相应量的三聚氰胺。Carrez I 溶液（250 μL）和Carrez II溶液（250 μL）相继添加到样本中，混合物漩涡10 s，然后离心（台式离心机Eppendorf，室温下3 000 rpm离心5 min）。将上层液体（0.5 mL）分别转移到一个玻璃试管中，然后用等体积的样本稀释缓冲液稀释。根据ELISA试剂盒说明书对稀释液进行分析。为检测免疫反应，CM样本加入标准的三聚氰胺衍生物，如三聚氰酸二酰胺、三聚氰胺一酰胺、三聚氰酸和环丙氨嗪（杀虫剂）以及兽药环丙沙星、氯霉素、磺胺甲嘧啶和青霉素G。

2.3.2 检测条件

将100 μL添加标准品或样本的溶液（0、20、50、100、200和500 ng/mL）分别一式2 份，每份加入三聚氰胺HRP酶交联物50 μL，室温孵育30 min后，用250 μL洗涤液洗涤4 次，然后添加基质溶液100 μL。室温培养30 min后，加入100 μL终止液后，使显色反应终止，使用分光光度计于450 nm下测定吸光值。

2.3.3 定量

通过标准曲线（线性log回归）计算未知浓度。每个试验都设有阳性对照和阴性对照。

2.4 HPLC-UV

2.4.1 样本的处理

称取5 g CM、1 g MBPIF样品（蛋白质含量大于15%）或2 g MBPIF样品（蛋白质含量小于15%）装入50 mL离心管中。向粉末样品中加入5 mL蒸馏水，搅拌使粉末溶解后，加入新鲜配制的三氯乙酸（2%）∶乙腈（1∶9）溶液5 mL，剧烈摇动1 min，然后将离心管在室温下放置15 min，再以4 000×g离心10 min。同时，用6 mL甲醇和6 mL水处理MCX强阳离子交换固相萃取柱6 cc/500 mg。将离心后所得上清液（4 mL）缓慢通过柱子。洗脱之前用蒸馏水（2×6）mL和甲醇（2×6）mL，然后用5 mL含有1.25%氨的甲醇溶液直接洗脱入7 mL小瓶中。洗脱液于50 ℃氮气吹干，再溶解于1 mL 0.1%的甲酸∶乙腈混合液（9∶1）中，HPLC分析之前用0.45 μm再生纤维素过滤器过滤。

2.4.2 仪器条件

液相色谱分析是利用Waters四元泵装置（Waters Alliance）通过C18液相层析柱（Discovery C18，250 mm×4.6 mm，5 μm，Supelco）进行的。流动相由溶液A和溶液B组成，溶液A为辛基磺酸（33 mM）溶于按85∶15体积比配成的磷酸盐缓冲液-乙腈水溶液；溶液B为乙腈。100%的溶液A等度分离15 min，然后用50%溶液A和50%溶液B洗脱1 min（液相层析柱用100%溶液A再冲洗4 min）。流速设为1.0 mL/min，将10 μL稀释液注入柱中。于240 nm测定吸光度并于200～400 nm记录紫外光谱加以验证。通过与纯三聚氰胺标准品比较保留时间和峰的紫外光谱特征来鉴定三聚氰胺。

2.4.3 定量

通过外标法标准曲线定量三聚氰胺，该标准曲线所含有的三聚氰胺浓度范围在0.1～5.0 μg/mL （x），通过与相应的标准曲线比较峰高（y）来定量试验溶液的三聚氰胺浓度。通过计算响应系数（RF，RF = y/x）平均值的相对标准偏差来检验紫外反应的线性度，线性度应当低于15%（Rodriguez，Orescan，1998）。

2.5 GC-MS

2.5.1 样品的前处理

称取0.5 g被检的MBPIF装入50 mL的聚丙烯管中，加入（13C3，15N3）-三聚氰胺（浓度为2 μg/mL水溶液25 μL）作为内标，同时加入2.5 mL水。再加入20 mL乙腈和1.25 mL 98%～100%的甲酸之前，MBPIF要小心混匀（漩涡至少10 s）。得到的溶液剧烈摇动1 min，然后用Multifuge 3s型离心机室温4 000×g离心5 min。预先用酸性甲醇[2×5 mL甲酸-甲醇（1∶99，v/v），环境压力下最大3 mL/mim]和酸化水[2×5 mL甲酸-水（1∶99，v/v），环境压力下最大3 mL/mim]处理OASIS MCX固相萃取柱，除去洗脱液。进一步用水（2×5 mL，环境压力下最大3 mL/min）冲洗柱2 次，再用甲醇冲洗2 次（2×5 mL，环境压力下最大3 mL/min）。然后被测物用碱性乙腈[5 mL 25%氨溶液-乙腈（20∶80，v/v）， 环境压力下最大3 mL/min]洗脱。洗脱液于50 ℃用氮气吹干，残留物溶于0.1 mL嘧啶并在加入双三甲基硅基三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷（99∶1，v/v，0.1 mL）后衍生（80 ℃，45min）。最后，用0.2 μm再生纤维素过滤器过滤并注入GC-MS（1 μL）。

表1 通过GC-MS检测离子分析三聚氰胺和同位素标记的同源物以及带有根据委员会决议2002/657/EC验收界限的峰面积比

2.5.2 仪器条件

使用HB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm；膜厚度0.25 μm），通过GC7890与MSD5975C联合来进行GC-MS分析。在15 psi恒压下以氦气作为载气。250 ℃分流进样，引入样品（1 μL）。烘箱温度设定程序如下：70 ℃（1 min）， 25 ℃/min达150 ℃，3 ℃/min达190 ℃，50 ℃/min达280 ℃（10 min）。离子源温度为230 ℃。在70 eV产生电子轰击电离源并以SIM模式停留20 ms获得（表1）。使用Quant Browser程序（http：//home.telfort.nl/sp984084/products/quantbrowser_gcms/）对峰进行评价与整合。

2.5.3 定量

MBPIF处理样在5 个标度水平下，范围从0～1.425 ng（与此范围等价的浓度为0～0.570 mg/kg）注入到柱中，内标物固定注入0.25 ng（样品含0.1 mg/kg），通过外标法标准曲线[被测物/内标物面积比（y）对被测物/内标物浓度比（x）]定量三聚氰胺。通过计算相应系数（RF，RF=y/x）平均值的相对标准偏差来检验质谱结果的线性度，线性度应当低于15%（Rodriguez，Orescan，1998）。C

〔本文翻译自：Petra Lutter,Marie-Claude Savoy-Perroud, etal.Screening and confirmatory methods for the determination of melamine in cow’s milk and milk-based powdered infant formula: Validation and proficiencytests of ELISA, HPLC-UV, GC-MS and LC-MS/MS. Food Control, 2011（22）:903-913.〕

（未完待续）