枳实、枳壳挥发油化学成分及抑菌活性的比较研究

施学骄，张杰红，樊丹青，刘友平

《中国药典》2010年版规定枳实、枳壳均来源于芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥果实[1]。因采收期不同而成为不同的两味药，枳实5~6月收集自落果实，枳壳7月果皮尚绿时采收。黄酮、生物碱、挥发油是其主要药理活性成分，其中枳实挥发油对耐药金黄色葡萄球菌有抑制作用[2]，为解决临床治疗耐药金黄色葡萄球菌感染提供了依据。

以往文献对枳实、枳壳挥发油的研究多集中在枳壳或枳实挥发油成分的分析，也有对枳实挥发油抑菌实验的研究[2~6]，但二者在不同生长期的挥发油成分动态累积变化对抑菌活性的影响研究尚未见相关报道。影响中药药效的因素有很多，其中气候对其次生代谢产物的累积有重要影响，并且中药中存在很多来源相同因采收期不同而分为两味药单独使用的，比如陈皮和青皮、枳实和枳壳等。因此，比较分析枳实、枳壳挥发油的成分差异与抑菌活性，为解决细菌对抗生素的耐药性、寻求天然副作用较小的中药抗菌活性成分提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent Technologies 7890A GC System，PYXDHS-40×50-S隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂），AIR TECH无菌操作台（苏净集团安秦公司）。

1.2 材料

实验用枳实、枳壳原药材购于湖南省沅江市地产药材收购站，经成都中医药大学卢先明教授鉴定为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的干燥未成熟果实。乙醚等试剂为分析纯，水为双蒸水，所用标准金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26002]、标准大肠杆菌[CMCC（B）44102]均购自成都市食品药品检定所，其余为临床分离菌株，由成都中医药大学附属医院提供。

2 方法

2.1 枳实、枳壳挥发油的提取

参考《中国药典》2010年版附录XD甲法提取。提取的挥发油用无水Na2SO4干燥，封装备用。

2.2 枳实、枳壳挥发油的定性与定量分析

2.2.1 气相色谱分析条件 色谱柱为Agilent 19091S-433HP-5MS(0.25 mm×30 m×0.25 μm)；进样口温度280 ℃；载气为氦气，流量：1.0 mL/min；分流比10：1，进样量1 μL；升温程序柱温60 ℃，保持3 min，以2 ℃/min升至80 ℃，再以5 ℃/min升至120℃，再2 ℃/min升至160 ℃，最后以15 ℃/min升至260 ℃，然后保持至分析完成。

2.2.2 气相色谱-质谱分析条件 电离方式：EI，电子轰击能：70eV；离子源温度230℃，四级杆温度150℃；扫描范围：50～400 amu；扫描频率：2.1次/s。

2.3 枳实、枳壳挥发油的体外抑菌试验

细菌培养基为营养肉汤，用抑菌圈直径(mm)的大小表示抑菌效力。

3 结果

3.1 枳实、枳壳挥发油成分的鉴定

枳实、枳壳挥发油取适量用乙醚溶解稀释，过0.22 μm微孔滤膜。挥发油GC-MS的总离子流图见图1、图2。对各峰经MS扫描后得MS图，经过质谱计算机数据系统检索（质谱数据库NIST08）与CAS号查询，结合相关文献，综合各项分析鉴定，确定其成分，结果见表1。

表1 枳实、枳壳挥发油的化学成分

35 苯甲醛 C7H6O 0.02 36 香茅醛 C10H18O 0.07 37 龙脑 C10H18O 0.03 38 三甲基苯甲醇 C10H14O 0.22 39 2,3-二氢-2,2,6-三甲基苯甲醛 C10H14O 0.03 40 百里香酚醚 C11H16O 0.36 41 胡椒酮 C10H16O 0.03 42 2-(甲氨基)苯甲酸甲酯 C9H11NO2 0.08 43 [3S-(3α,3Aβ,5α)]-1,2,3,3A,4,5,6,7-八氢化-α,α-3,8-四甲基-5-奥甲醇 C15H26O 0.06 0.12 44 植酮 C18H36O 0.03 0.26 45 亚油酸甲酯 C19H34O2 0.37 1.21 46 蛇床子素 C15H16O3 0.08 1.36 47 3,6-二氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃 C10H16O 0.07 48 香茅醇 C10H20O 0.2 49 壬酸 C9H18O2 0.05 50 十一醛 C11H22O 0.15 51 癸酸 C10H20O2 0.12 52 合金欢醇 C15H26O 0.08 53 油酸 C18H34O2 0.37

3.2 枳实、枳壳挥发油的抑菌效果观察

3.2.1 抑菌活性实验 (1)盐酸四环素标准品溶液制备

称取盐酸四环素标准品50 mg，加无菌水适量配制成5 g L-1，用无菌水稀释并定容成0.05 μg mL-1做标准品溶液，备用。

(2)增菌培养 取标准金黄色葡萄球菌、标准大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌菌株少许，接种营养肉汤培养基中，37 ℃培养18h。

(3)抑菌效果 取20 mL熔化后的营养琼脂倒入9 cm平板，待其凝固。用移液枪吸取0.1 mL菌液均匀涂布于凝固的营养琼脂平板上，用无菌钢管打3个孔，注入0.05 mL挥发油，每块平板涂布一种实验菌；以盐酸四环素标准品作为阳性对照；以含适量聚山梨酯80的生理盐水作为阴性对照。37 ℃培养24 h后，用直尺测量抑菌圈直径，结果用抑菌环直径（mm）表示，观察各自抑菌活性，见表2。

表2 枳实、枳壳挥发油的抑菌活性

从表2可知，枳实、枳壳挥发油对各细菌均有抑菌效果，枳实、枳壳挥发油对不同的细菌有不同的抑菌作用，对同一细菌的抑菌作用存在差异。从总体来看，枳壳挥发油的抑菌活性相对较强，标准品的抑菌活性比枳实、枳壳较强。

3.2.2 最低抑菌浓度实验 (1)样品配制 分别精密吸取枳实、枳壳挥发油1.5 mL并称重，用含适量聚山梨酯80的生理盐水稀释成1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512后，制成无菌样品，备用。

(2)最低抑菌浓度测试 取1.5 mL的稀释药液放入12.5 mL营养琼脂培养基中，混匀后倒入9 cm平板，待其凝固后分别接种上述细菌，37 ℃培养24 h，观察结果，结果见表3。

表3 枳实、枳壳挥发油最低抑菌浓度(MIC)/g·L-1

从表3可以看出，枳实、枳壳挥发油对各实验菌均有抑制作用，其中枳壳挥发油对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度几乎是枳实挥发油的两倍，而对其它细菌的最低抑菌浓度相差不大。

4 讨论

4.1 枳实、枳壳挥发油不仅在化学成分的种类上存在差异，而且各成分的含量也不同。柠檬烯、芳樟醇、alpha-松油醇是二者共有成分中含量最高的三种，除alpha-松油醇外，其它两种成分均是枳实中含量高于枳壳。其中柠檬烯有镇咳、祛痰、抗菌的作用；芳樟醇有防腐、抗病毒、镇静作用[7]。

4.2 通过观察提取的挥发油，发现枳壳挥发油的颜色较枳实深，枳壳为深黄色，枳实为浅黄色，且枳实挥发油的提取率高于枳壳。结合挥发油成分的GC-MS分析结果，枳壳中大分子化合物含量高于枳实，小分子化合物含量低于枳实。随着生长期的延长，挥发油的总量在减少，小分子化合物含量在减少，大分子化合物含量在增加，这可能导致枳实、枳壳挥发油在颜色上的差异。抑菌实验的结果也显示枳壳挥发油的抑菌效果强于枳实，是否与小分子化合物含量减少和大分子化合物含量增加有联系需进一步深入研究。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:230.

[2] 廖凤霞,孙冠芸,杨致邦,等.枳实挥发油的化学成分分析及其抗菌活性的研究[J].中草药,2004,35(1):20.

[3] 龚千锋,钟凌云,曹君,等.不同产地枳壳饮片炮制前后挥发油GC-MS分析[J].中成药,2007,29(11):1639.

[4] 廖凤霞,辛龙涛,陈华,等.中药枳实与枳壳挥发油成分对比分析[J].重庆大学学报,2004,27(5):38.

[5] 曹君,王少军,龚千锋,等.不同产地枳壳饮片炮制前后挥发油成分的GC-MS分析[J].中草药,2005,36(2):172.

[6] 蒋以号,杨先玉,张庆华,等.枳壳樟帮法炮制前后挥发油的GC-MS分析[J].中药材,2010,33(8):1233.

[7] 孙文基,马力,黄承钰,等.天然活性成分简明手册[M].北京:中国医药科技出版社,1998.