鼻咽癌组织中COX-2与VEGF-C基因表达的研究

李建萍 ，张小清 ，罗 雄 ，左克强 ，谢 明 ,2

(1.湘南学院基础医学部，湖南 郴州 423000;2.湘南学院附属医院病理科，湖南 郴州 423000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国南方常见的头颈部恶性肿瘤之一，它的发生发展涉及多重基因改变的复杂过程。近来研究报道，环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在多种肿瘤组织中表达增强，并认为与肿瘤新生血管的生成、肿瘤的发生、浸润和转移密切相关，是肿瘤防治的新靶点[1]。而血管内皮生长因子(vascular an-dothelial growth factor,VEGF)是目前发现的最重要的血管生成因子，在多种肿瘤组织中高表达，并与肿瘤的浸润、转移和预后不良密切相关，可作为肿瘤代谢及转移的标志[2]。本研究采用RT-PCR方法测定NPC组织中COX-2、VEGF-C表达状况及其相关性，探讨COX-2、VEGF-C基因在鼻咽癌发生发展中的作用及临床意义，为NPC临床诊断、预测转移和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集湘南学院附属医院2010年5月～9月确诊原发鼻咽癌而未做放疗和化疗的患者癌组织标本32例，年龄40～73岁，取距癌组织边缘约2 cm的癌旁组织、经病理证实无肿瘤细胞浸润、无明显炎症病变鼻咽正常组织标本11例，立即经液氮冷冻后，置入-80℃冰箱冷冻保存。所有标本经病理诊断为鳞状细胞癌，其中低分化20例，分化鳞癌12例；有淋巴结转移15例，无淋巴结转移17例。

1.2 主要仪器与试剂

低温高速离心机和-80oC低温冰箱购置美国Thermo Forma公司，PCR仪购置德国Eppendorf公司，凝胶成像分析仪购置法国Vllber Lourma公司，RT-PCR试剂盒购置Promega公司，VEGF、COX-2与内参GAPDH引物购置北京赛百胜基因技术公司。

1.3 RT-PCR半定量检测COX-2 mRNA与VEGF-C-mRNA表达

取鼻咽癌与癌旁正常组织100 mg，剪碎后1 mL Trizol置玻璃匀浆器内，用液氮匀浆10 min，按照Trizol试剂说明程序提取细胞总 RNA，取1 μg RNA经逆转录酶在下列条件下合成cDNA：25℃5 min，40℃ 60 min，75℃ 15 min。 用该 cDNA 作为模板进行PCR反应。COX-2(304 bp)：上游引物5'-TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA ATT GCT-3'；下游引物5'-AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT-3'。 VEGF-C(398bp)：上游引物 5'-GGG CTT ATG CAA GCA AAG AT-3'；下游引物 5'-GAG GTA GCT CGT GCT GGT GT-3'。 用GAPDH 扩增产量为内参照GAPDH(594bp，上游引物5'-CCA ATA TGA TTC CAC CCA TG-3'；下游引物5'-AGG TCC ACC ACT GAC ACG TT-3')。PCR反应如下：95℃ 3 min 后，94℃ 30s、54℃ 45s、72℃ 50s进行 35个循环，72℃延伸10 min终止反应。将PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳后，置凝胶成像分析仪中摄影，采用1D图像分析系统(BIO-PROFIL Bio-1D Windows Application V10.02法国 )测吸光度值，用COX-2、VEGF-C吸光度与GAPDH吸光度的比值代表COX-2 mRNA、VEGF-C mRNA的相对含量。

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行χ2检验、t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COX-2-mRNA与VEGF-C-mRNA表达

鼻咽癌组织COX-2-mRNA的表达阳性率为68.7%(22/32)，相应癌旁组织为 27.3%(3/11)，差异有显著意义(χ2=5.786，P＜0.01)；鼻咽癌组织 COX-2-mRNA相对含量为0.9533±0.0463，显著高于相应癌旁组织 0.6350±0.1127(t=5.99，P＜0.05)。 见图 1。

鼻咽癌组织VEGF-CmRNA的表达阳性率为71.9%(23/32)，相应癌旁组织为 18.2%(2/11)，二者阳性率差异显著 (χ2=9.696，P＜0.005)； 鼻咽癌组织VEGF-C mRNA相对含量为0.8050±0.0774，显著高于相应癌旁组织 0.5830±0.1063(t=6.471，P＜0.01)。 见图 2。

2.2 COX-2 mRNA、VEGF-C mRNA 表 达 与NPC淋巴结转移的关系

COX-2 mRNA表达与NPC淋巴结转移有关(χ2=4.219，P＜0.05)，见表 1。 VEGF-C mRNA 表达与 NPC 淋巴结转移亦有关 (χ2=6.431，P＜0.01)，见表2。

表2 VEGF-C-mRNA表达与NPC淋巴结转移的关系

3 讨论

COX-2是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶，COX-2基因 8 kb位于染色体 1q 25.2～25.3，编码COX-2含有603或604个氨基酸，是诱导型的表达基因，除巨噬细胞、成纤维细胞、软骨细胞、肾小球致密斑等区域外，大多数组织不表达,当受到细胞内外、肿瘤坏死因子、一氧化氮等刺激因素的诱导时,其表达可迅速上调[3]。本实验对COX-2 mRNA表达的研究结果显示，COX-2 mRNA在鼻咽癌患者中阳性率为68.7%，相应癌旁正常组织27.3%，两者差异非常显著；并且COX-2mRNA的表达水平与淋巴结转移相关，在有淋巴结转移患者的鼻咽癌中，COX-2mRNA的表达显著高于无淋巴结转移者，由此说明COX-2基因的表达与鼻咽癌的发生、发展、转移密切相关。 COX-2基因可能通过抑制凋亡相关基因 bcl-2、Caspas-3等的活性，抑制细胞凋亡，造成细胞过度增殖而导致肿瘤的发生；COX-2基因能促进有免疫抑制效应作用的前列腺素的合成，当前列腺素合成增加的同时抑制机体免疫功能，增加肿瘤细胞的侵袭能力、促进血管生成，最终导致肿瘤的发生和进展[4]。Murono S等研究报道，COX-2及其催化产物 PGE2和 PGJ2等，作用于相关受体,经由 EP/c AM P等途径或通过核受体直接进入核内，诱导以血管内皮生长因子 (VEGF)为主的促血管生成因子表达上调，并且参与了EB病毒的致癌蛋白LMP1诱导VEGF表达的调控[5]。刘宁宁等的研究证实：COX-2介导幽门螺杆菌诱导人胃癌细胞VEGF表达增强[6]。VEGF-C是VEGFs家族中第一个被发现的淋巴内皮细胞生长因子,VEGF-C通过与特异淋巴管内皮的受体结合，介导受体酪氨酸激酶信号系统，调节肿瘤血管新生和淋巴管生成，促进肿瘤细胞进入淋巴管，通过淋巴系统向全身转移和扩散[7]。王日雄[8]等在对大鼠乳腺癌骨转移研究中发现：大鼠乳腺癌局部高表达COX-2蛋白，VEGF蛋白表达上调，促进其乳腺骨转移癌的发生。本研究中，鼻咽癌组织VEGF-CmRNA阳性表达率明显高于鼻咽非肿瘤组织；同时，鼻咽癌中 VEGF-C mRNA高表达者淋巴结转移率也增高,淋巴结转移与 VEGF-C高表达密切相关，其结果与赵国光[9]等研究结果相同，从而进一步证实了VEGF-C作为促血管生长因子在鼻咽癌淋巴转移中起了重要作用，目前研究的解释是[10]：恶性肿瘤细胞 VEGF-C mRNA表达增加时产生VEGF-C增加,激活淋巴管内皮细胞上 VEGFR-3受体,刺激淋巴管内皮增生,诱导癌周淋巴管增生,并降低淋巴管内皮细胞间的粘附,提高淋巴管通透性,增加了肿瘤淋巴转移机会。 Strauss L等[11]研究也提出，在头颈部鳞癌中的多项研究中,肿瘤组织中VEGF-C表达显著增加,VEGF-C表达增加对颈部淋巴结转移有预示价值。

本研究从转录水平证实鼻咽癌组织存在着COX-2与VEGF-C基因的过表达，并且COX-2与VEGF-C基因表达与鼻咽癌淋巴结转移密切相关，因此，对鼻咽癌的抗转移治疗采用同时抑制COX-2与VEGF-C基因的表达，值得进一步深入研究。

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