湘潭市手足口病病原学实验室检测分析

王中秋，陈子君，杨 敏

(湘潭市疾病预防控制中心，湖南 湘潭 411100)

手足口病(HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病，主要病原体为肠道病毒71型(EV71)，柯萨奇病毒A组16型(CA16)及埃可病毒(ECHO)的某些血清型。其临床症状主要表现为四肢末端水泡样皮疹及口腔黏膜溃疡性疱疹。其中EV71引起的手足口病还可以引起严重的中枢神经系统并发症，如脑膜炎，脑炎急性迟缓性瘫痪等[1-2]。2008年5月2日卫生部将手足口病纳入丙类法定传染病管理范畴，并公布了相应的诊疗、防控指南[3,4]。湘潭市自2008年4月出现手足口散发病例，随后，湘潭市CDC迅速开展了手足口病病原学检测，检测方法为实时荧光PCR，试验流程为：先对样品进行总肠道病毒检测，对总肠道病毒阳性样品进行EV71和CA16分型检测，EV71和CA16之外的肠道病毒不再分型，统称为其它型。本文根据湘潭市755例临床诊断为手足口病的患者样品的病原学实验室检测结果，分析本市手足口病的病原学流行特征，同时评估不同样品的阳性检出率，为本市的手足口病防控提供科学依据，报告如下。

1 资料与方法

1.1 样品来源

临床诊断为手足口病的患者样品共计755份，分别为湘潭市五个县区CDC送检的监测病例样品，以及本市各医院收治的手足口重症病例样品。

1.2 检测方法

RNA提取：采用英韦创津公司生产的病毒RNA提取试剂盒提取样品中的RNA。实时荧光PCR检测：使用上海硕世生物科技有限公司生产的总肠道病毒RNA及EV71型，CA16型RNA双通道实时荧光检测试剂盒，以ABI7300实时荧光PCR仪进行检测。具体操作及结果分析均严格按照所用试剂盒使用说明进行，并在试剂有效期内使用。

1.3 数据统计分析 使用SPSS17.0数据统计软件进行数据统计和分析。

2 结果

湘潭市CDC对本市五个县区CDC送检的手足口监测病例样品及本市各医院收治的重症病例送检样品进行手足口病毒RNA进行检测分析，检测数据如下。

2.1 监测病例样和重症病例样实验室检测结果与分析

在755份样品中，监测病例样品为652份，由各医院送检的重症病例样品为103份。在652份监测病例样品中，总肠道病毒阳性样品446份，其中EV71型阳性199份，占44.62%，CA16型阳性176份，占39.46%，其它型肠道病毒阳性71份，占15.92%。在103份重症病例样品中，总肠道病毒阳性91份，其中EV71型阳性78份，占85.71%，CA16型阳性3份，占3.29%，其它型肠道病毒阳性10份，占 10.10%，结果见表1。

652份监测病例样本EV71型阳性率与CA16型阳性率比较，P＞0.05，无统计学意义；EV71型阳性率与其它型阳性率比较，P＜0.05，有统计学意义；CA16型阳性率与其它型阳性比较，P＜0.05，有统计学意义。说明该地手足口病流行病毒主要是EV71和CA16交替流行型，其它型占少数。

103份重症病例样本EV71型阳性率与CA16型比较，P＜0.05；和其它型比较，P＜0.05。 其它型阳性率与CA16型比较，P＜0.05。以上数据说明重症病例主要由EV71型引起，其次是其它型，其它型引起重症病例的比率高于CA16型，因此，开展对其它型进行明确分型很重要。

表1 监测病例与重症病例实验室检测结果表

2.2 不同样品的实验室检测结果与分析

送检的755份样品中，咽拭子标本493份，疱疹液标本188份，粪便标本74份。从493份咽拭子样品中检出总肠道病毒阳性者319份，其中EV71阳性165份，占总阳性数的51.72%，CA16阳性106份，占33.23%，其它48份，占15.05%。从188份疱疹液标本中，检出总肠道病毒阳性155份，阳性率82.45%，其中EV71阳性79份，占50.97%，CA16阳性52份，占33.72%，其它阳性24份，占15.12%。从74份粪便标本中，检出总肠道病毒阳性63份，阳性率85.14%，其中EV71阳性33份，占45.63%，CA16阳性21份，占33.33%，其它9份，占14.29%。检测结果见表2。

各组总肠道阳性率比较：疱疹液组与咽拭子组比较，P＜0.05，有统计学意义；粪便组与咽拭子组比较，P＜0.05，有统计学意义；疱疹液组与粪便组比较，P＞0.05无统计学意义。从以上各组比较结果可以看出：疱疹液和粪便样品的阳性检出率明显高于咽拭子。

表2 从不同部位采集的病例样品实验室检测结果表

3 讨论

手足口病是一种常见的出疹性流行病，已知的能引起手足口病的病原体多达20余种，均属小核酸核糖病毒科，人肠道病毒属，其中以EV71和CA16最为常见[1-2]。手足口病病原学非常复杂，传播途径多样，传染性强，传播速度快，流行期长，容易爆发流行，而且至今为止尚未推出有效的疫苗，由此种种，给该疾病的防控带来了很大的难度。

目前，手足口病的病原体实验室检测技术不外乎病毒培养，病毒核酸分子生物学检测，血清学检测三种方法。病毒培养耗时过长，无法满足临床诊断需求，而可靠的血清抗体检测试剂至今尚未推出。相比之下，病毒核酸分子生物学检测所需时间大致在半个工作日左右，而且，分子生物学检测所独具的高度敏感性，特异性，能为手足口病的确诊提供科学可靠的依据，因此，分子生物学成为当前诊断手足口病的最佳选择。毫无疑问，每一种检测方法都有其局限性，对于分子生物学检测而言，所提取的RNA／DNA的质量和数量对检测结果的准确可靠与否起着至关重要的作用。因此，在检测人员技术成熟，检测试剂和其它试验用品合格并严格遵守操作规程的情况下，检测结果与患者实际情况相符与否完全取决于所采集的样品之质量。在实践工作中，我们发现，那些临床特征明显而实验室检测结果呈阴性的情况，往往出现在送检样为咽拭子的病例中，而在重新采集疱疹液或肛拭子进行检测时却能得到阳性结果。我们认为，这应归因于手足口病患者主要是婴幼儿，采集咽拭子样品时不容易配合，往往造成样品不佳，进而影响检测结果。根据上文数据，疱疹液、肛拭子的阳性检出率明显高于咽拭子(P＜0.05)，基于此，我们建议，在对手足口病患者进行采样时，以采集疱疹液或肛拭子更为可靠，尤其对于那些不肯配合的患儿，要避免采集咽拭子。

湘潭市自2008年4月出现手足口病散发病例后，市疾病预防控制中心迅速采取了一系列的防控措施，迅速开展了针对该疾病的流行病学监测与病原学实验室检测。从病原学检测结果来分析，该市手足口病的流行病毒主要以EV71和CA16交替流行。手足口病重症病例主要由EV71引起，其在重症病例中的阳性比率远远高于CA16(P＜0.05)和其它型肠道病毒(P＜0.05)。其它型在重症病例中的阳性率比 CA16 高(P＜0.05)。

我国自1980年开始有手足口病的报道，1985年以前CA16是该病的唯一病原，最近研究结果显示EV71在手足口病的病原学中占有越来越重要的地位[5]。在EV71和CA16之外的其它型引起聚集性疫情或死亡病例的报道很多，如CoxB4引起手足口病聚集性疫情[6]；柯萨奇病毒B5型引起手足口死亡病例[7]，可见其它型引起爆发疫情和重症病例、死亡病例的存在已不容忽视，但当前国内对引起手足口病的病原体分型主要是EV71和CA16，而对其它引起该病的病原体分型尚未普遍开展，因此，对于手足口病防控与治疗而言，我们今后的工作方向应该是进一步对引起手足口病的其它病原体做出明确的分型以及其分子变异，耐药性等方面的研究。同时，加快该疾病疫苗的研究，早日推出行之有效的疫苗，是遏制该疾病的流行的重中之重。

[1]周世力,扬帆,金奇,等.肠道病毒71型研究进展[J].病毒学报,2003,19(3):284-286.

[2]陆一涵,姜庆五.人肠道病毒71型与手足口病[J].疾病控制杂志,2008,12(3):183-188.

[3]肠道病毒(EV71)感染诊断指南(2008年版)[S].2008.

[4]中华人民共和国卫生部.2008年手足口病预防控制指南.

[5]林思恩,章青,谢华萍,等.我国广东、福建地区 2000-2001年手足口病肠道病毒71型分离株的种系进化分析[J].中华实验和临床病毒学杂志,2004,8(3):27-29

[6]马智龙,查杰.一起由肠道病毒CoxB4引起的手足口病聚集性疫情的病原学鉴定及其基因型分析[J].中国卫生检验杂志,2011,21(10):2361-2363.

[7]吉彦莉,王永全,刘国涛.一例重症手足口病死亡患儿柯萨奇病毒B5型VP4区基因特征分析[J].中国卫生检验杂志,2011,21(10):2377-2378.