鸡肾传支继发大肠杆菌病的诊断及细菌耐药性检测

张荣武 （山东省陵县畜牧局 253500）

2011年12月，泰安市某蛋鸡厂饲养的60日龄的柴公鸡发生大批量死亡。病鸡精神沉郁，食欲废绝，羽毛松乱，翅膀下垂，呼吸困难，喷嚏，有呼吸啰音，鼻腔常有分泌物流出，怕冷扎堆。剖检发现病死鸡气囊浑浊，心包浑浊，气管环有出血，个别鸡支气管有干酪样栓塞，肝脏肿大，肾脏肿大有尿酸盐沉积，腺胃乳头肿大个别鸡腺胃乳头出血，十二指肠有点状出血，盲肠扁桃体肿大，法氏囊萎缩。该鸡场爆发的疾病疑似肾型传染性支气管炎，为进一步确诊进行实验室诊断。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 伊红美蓝培养基，麦康凯琼脂、生化试剂微量管(均购自杭州天和微生物试剂有限公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物技术公司)；ExTaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、Trans2K DNA Marker购自北京全式金生物科技有限公司；IB、H9、ND病毒抗原购自哈尔滨兽医研究所。

1.2 细菌分离及初步鉴定 用无菌接种环取病死鸡的肝脏、心脏，划线接种于麦康凯琼脂平板，37℃培养18～24h，在麦康凯琼脂平板上挑取红色菌落接种于伊红美蓝平板，革兰氏染色，观察细菌形状和染色特性。

1.3 生化反应鉴定 将分离菌接种于蔗糖、水杨酸、D-木糖、硫化氢、卫矛醇、乳糖、麦芽糖、L-阿拉伯糖、甘露醇、间-肌醇、尿素酶、七叶苷水解、葡萄糖、山梨醇、吲哚、M-R、V-P、枸橼酸盐利用、明胶液化等19项生化试验。

1.4 分子生物学方法鉴定 根据GenBank上公布大肠杆菌的序列在其高度保守的区域分别设计一对引物用来鉴定大肠杆菌，上游5-atgcgacttgataaatttat-3，下游5-ttagacgacgctggcaatt-3。鉴别扩增体系如下：PCR扩增体系：10×buffer2.5μl；Mg2＋2μl；上游引物0.5μl；下游引物0.5μl；模板DNA0.5μl：dNTP0.5μl；双蒸水18.3μl；ExTaq DNA聚合酶0.2μl。扩增条件：94℃预变性10min(94℃变性50s，57℃退火50s72℃延伸1min30s，30个循环)72℃延伸10min。

1.5 琼扩试验 随机抽取该鸡群的5只鸡无菌条件下从鸡的翅静脉采血2ml左右，静置血样。待血液凝固后，分离血清。琼脂平板的制备:取琼脂粉和生理盐水按比例溶解，煮沸至颜色澄明。经冷却后倒入灭菌好的培养皿中，厚度约2mm，静置冷却备用。凝固后进行打孔，中央1个，周围6个，孔径3mm，孔距4mm。上方孔为第1孔，按顺时针方向分别称为2、3、4、5和6孔，中央孔为7孔。将标准抗原放置在琼脂板的中央孔内，将标准血清加入1孔，作对照，其他孔加待检血清。37℃温育12h～24h后观察结果。当抗原孔与阳性血清孔之间出现沉淀线时，待检血清孔与抗原孔之间也出现沉淀线，判为阳性，不出现沉淀线者判为阴性。

1.6 鉴别诊断 用上述提取的血清分别测该鸡群的H9、新城疫抗体效价。

1.7 药敏试验 用接种环于营养琼脂培养基上挑取分离纯化的大肠杆菌菌落4～5个，接种于3～5ml LB液体培养基中。37℃培养12h，用生理盐水稀释至与0.5麦氏标准比浊管浊度相同的浓度。在15min内，用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的菌液后均匀涂布于M-H琼脂平板上，待干。用镊子蘸取95%乙醇并通过火焰，待烧干后再蘸取乙醇重复上述操作，共3次。待冷却后，用此无菌镊子夹取不同药敏纸片，按一定间隔贴在平板的不同区域，即两纸片间距不小于24mm，纸片距平板边缘不小于15mm，37℃温箱培养24h观察结果。用大肠杆菌ATCC25922作为质控菌。(本次试验选取药敏片：阿莫西林、氨苄西林、头孢曲松、头孢噻肟、丁胺卡那、庆大霉素、安普霉素、强力霉素、环丙沙星、氟苯尼考、磷霉素、恩诺沙星)。

2 试验结果

2.1 细菌分离鉴定结果 分离菌在麦康凯培养基上菌落均呈鲜桃红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑湿润。分离菌的菌落在伊红美蓝培养基上生长呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽。革兰氏染色发现分离菌为革兰氏阴性小杆菌，呈单个形式存在。通过分离菌在麦康凯与伊红美蓝培养基上的生长特性，可以初步判断该细菌为大肠杆菌。

2.2 分离菌生化鉴定结果 如表1所示根据《常见细菌系统鉴定手册》上面关于大肠杆菌鉴定，可以确定该株细菌为大肠杆菌。

表1 分离菌生化特性

2.3 分离菌PCR鉴定结果 根据GenBank上有关大肠杆菌高度保守的序列设计引物，PCR鉴定结果如图1所示分离菌扩增得到一条大小为713bp的片段与目的片段大小一致。通过培养特性试验、生化试验和分子生物学鉴定可以确定分离菌为大肠杆菌。

图1 大肠杆菌PCR鉴定

2.4 琼扩试验结果 琼扩结果显示1-6孔皆有白色沉淀线产生，说明该5份待检血清为传染性支气管炎阳性血清。

表2 待检血清抗体效价 (log2)

2.5 鉴别试验结果 新城疫、禽流感血凝抑制抗体检测结果如表2所示。H9效价偏低说明该鸡群应当免疫H9，亦可证明无野毒感染。ND抗体效价低于保护效价，该鸡群应免疫ND疫苗。

2.6 药敏试验结果 由表3可知该次试验分离的大肠杆菌对于阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素、安普霉素、恩诺沙星、磷霉素、强力霉素、丁胺卡那耐药，对于头孢曲松、头孢噻肟中度敏感，环丙沙星敏感。

表3 药敏试验抑菌圈直径 (mm)

3 结论

通过实验室诊断该鸡群IBV抗体阳性，据鸡场饲养人员描述该鸡场没有注射过传支疫苗所以该鸡场有野毒感染。该鸡群中分离并鉴定出大肠杆菌，证明该鸡群是爆发肾型传染性支气管炎继发大肠杆菌病。测H9、ND抗体显示H9、ND抗体偏低没有达到保护效价，应及时免疫。通过测抗体说明该鸡群没有感染新城疫、禽流感H9。药敏试验结果显示该鸡群感染的大肠杆菌耐受多种药物，只有头孢曲松与头孢噻肟中度敏感，对环丙沙星敏感。治疗方案：改善饲养管理条件，降低鸡群密度，饲料或饮水中添加环丙沙星以防治大肠杆菌继发感染。降低饲料中蛋白的含量，并注意补充钠和钾。可考虑使用家禽基因工程干扰素配合抗菌素、抗病毒药物、中草药、电解多维等对症治疗的综合防治措施。

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