犬细菌性腹泻的细菌分离培养与鉴定

张 丽 （云南省弥勒县畜牧兽医局 652300）

肖 啸* （云南农业大学动物科学技术学院 昆明）

沈学文 （云南省红河州动物疫病预防控制中心 蒙自）

犬的肠道内有大量潜在的致病菌，但不是每种细菌都与临床疾病有明确的联系。引起猪细菌性腹泻的原因很多，特别是大肠杆菌是引起仔猪腹泻的主要原因，其发病率高，死亡率不高[1]。大肠秆菌、痢疾秆菌、沙门氏秆菌、魏氏棱菌、螺旋体感染等，都可引起羊只的腹泻，并有可能发生较高的死亡率。其中以大肠杆菌引起的疾病最为严重，死亡率也最高。大肠杆菌也是引起牛细菌性腹泻重要原因[2]。犬的致病菌包括：肠致病型大肠埃希氏菌、无致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、小肠结肠炎耶尔森菌、弯曲菌属、毛状芽孢杆菌、梭菌属、葡萄球菌和志贺菌属。其中以由大肠杆菌引起的最为常见，各年龄段的犬都易感致病性大肠杆菌，但多见于1～4月龄的仔犬，临床上以败血症、发热和腹泻为特征，一年四季均可发生。但是由于春季气温多变，犬的抵抗力较弱，所以在春季本病表现的尤为突出。致病性大肠杆菌为革兰氏阴性菌、无芽孢、有鞭毛的短小杆菌。致病性大肠杆菌的血清型非常多，其中可能引起犬细菌性腹泻的血清型为O10、O85、O119、O18、O20、O70、O209、O339等。犬细菌性腹泻的症状一般为精神沉郁，被毛粗乱、脱水、消瘦、腹部鼓胀，拉稀或者便血，体温升高至40～41℃，有的犬伴有呕吐的症状。严重的发生水泻、肝门失禁呈里急后重，引起直肠脱出或伴发肠套叠的直肠脱出。发病动物采食量减少，极度消瘦、弓腰、眼窝下陷、乏力，临死前体温下降[3]。细菌性腹泻往往会带来动物死亡，生产性能降低等危害。那么引起犬细菌性腹泻的病菌及其血清型值得探讨。本试验通过对细菌性腹泻的犬粪便进行采样，通过麦康凯鉴别培养基[4]进行细菌的分离培养、生化试验与正常犬大肠菌群对比进行了细菌鉴定，再通过药敏试验找出细菌敏感的抗生素，这样便可以在实际的治疗中起到良好的指导作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物 庆大霉素、链霉素、林可霉素、头孢氨苄、菌必治等。

1.1.2 试验器材 生物显微镜、托盘天平、锥形瓶、电炉、载玻片、盖玻片、恒温培养箱、超净工作台、立式圆形压力蒸汽灭菌器、冰箱、接种环、酒精灯等。

1.1.3 试剂 乳糖、磷酸氢二钾、氯化钠、琼脂、胆盐、超纯水、中性红、结晶紫、95%乙醇、硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、蛋白胨水、葡磷胨水、拘橼酸盐、尿素、半固体琼脂、葡萄糖产气、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖等。

1.1.4 试验动物 试验犬均来自云南农业大学动物科学技术学院动物医院(西站)及康大妈流浪动物收容所。首先进行犬健康状况状况调查，调查内容包括品种、年龄、性别、体重、临床症状，引起犬腹泻的原因。根据犬的临床症状：出现呕吐，慢性肠卡他，厌食，稀便，血便，渐进性消瘦，营养不良，精神不振，体温升高，脱水等有典型腹泻症状，经诊断后排除病毒性腹泻及寄生虫腹泻可能的犬。

1.2 试验方法

1.2.1 粪样的采集 在动物医院里，由于不可能随时都能采到新鲜粪便样品，所以采用棉棒采集每只试验犬直肠深部少量粪便直接涂片观察，并编号记录被检犬的年龄、营养状况、品种、性别等，并保存待检。本次试验粪样采集时间为0d：2010年4月20日，采到3个样品分别编号1、2、3。1d：2010年4月21日采到4个样品分别编号4、5、6、7。2d：2010年4月22日采到3个样品，分别编号8、9、10。本次采样的犬品种不一，有北京犬、雪橇犬、金毛、博美等。年龄从1月龄至8岁之间。各个体的粪样分别取2份。

1.2.2 培养基制备 麦康凯琼脂培养基制备，麦康凯培养基用于肠道致病菌的选择性分离培养。配方如下蛋白胨20.0g，乳糖10.0g，胆盐5.0g，氯化钠5.0g，中性红0.03g，琼脂14.0g，pH值7.1±0.2，加热溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min备用。本次试验使用的是由上海市医学化验所试剂厂生产的麦康凯琼脂培养基，取样品52g加入1000ml蒸馏水中混合放置10min微火煮沸使之完全溶解，115℃高压灭菌15min备用。鉴定原理为蛋白胨提供碳氮源、维生素和生长因子；牛胆盐可抑制革兰氏阳性菌的生长；氯化钠维持均衡的渗透压；琼脂是培养基的凝固剂；乳糖为可发酵的糖类；中性红是pH指示剂，细菌发酵乳糖产酸时菌落呈粉红色并在菌落周围出现胆盐沉淀的浑浊圈。

1.2.3 粪样检测 每一个样品分别取少量的粪样经无菌纯水稀释后涂于载玻片上等干后用革兰氏染色法[5]染色之后进行镜检。

1.2.4 接种培养 将样品在超净工作台上分别接种到麦康凯琼脂培养基上，并且标明接种的编号。接种时用采样的棉签轻轻涂抹于培养基的一头，之后用接种环以“之”字型画开，每涂过培养皿的一半时旋转90°，接种环烧白灭菌后继续沿“之”字画开。接种完成后将培养皿放入37℃恒温培养箱培养24h。

1.2.5 生化鉴定 使用精氨酸、鼠李糖、乳糖、水杨素、甘露醇、蔗糖、七叶苷、半乳糖、果糖、山梨醇、葡萄糖、懒氨酸、麦芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、卫矛醇、甲基红实验、V-P试验、吲哚等分别配制生化鉴定管[5]。将培养皿中的典型菌种在超净工作台上接种至鉴定管中，24h后观察结果。

1.2.6 药敏试验 使用药敏纸片呋喃妥因、链霉素、头孢氨苄、环丙沙星、妥布霉素、庆大霉素、卡那霉素、林可霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、四环素、氯霉素、菌必治做两组药敏实验。以上药敏纸片均产自杭州天和生物试剂有限公司，执行标准：WS/T125-1999。

1.2.7 注意事项 在操作中严格按照无菌操作，使用明火、电时注意自身安全。实时记录试验数据。严格按照操作规程操作，注意保护设备安全完整。

2 试验结果

2.1 粪样检测结果

在每一个便样的镜检中视野内大量存在革兰氏阴性、中等大小、两端钝圆的短杆菌，呈单个或多个散在排列。从形态和革兰氏特性上判断在视野中的细菌为大肠杆菌[6](图1) 。

2.2 接种培养结果

所有麦康凯培养基中均有均匀红色，边缘整齐，中心突起，中等大小，表面光滑湿润的散在菌落长出。其中1号培养皿有菌落200个，2号有菌落185个，3号有菌落50个，4号有菌落130个，5号又菌落70个，6号有菌落150个，7号有菌落134个，8号有菌落124个，9号有菌落125个，10号有菌落113个(图2)。

图1 大肠杆菌革兰氏染色1600倍镜

图2 大肠杆菌在麦康凯培养基上的生长情况

2.3 生化实验结果

见表1。

表1 生化试验结果

2.4 药敏试验结果

见表2。

表2 药敏实验结果 (mm)

3 讨论

3.1 生化分析

生化试验结果与动物传染病书上大肠杆菌基本特性相符[8]，而且与王云峰等[9]、孙善发等[10]的试验结果相一致。该菌能够分解麦芽糖、果糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖、乳糖、山梨酸，产酸产气，不能产生硫化氢。因此从生化结果来看此菌种为大肠杆菌。

3.2 药敏分析

从药敏试验的结果来看，该菌对头孢类，和喹诺酮类[12]抗生素高度敏感，但是林可霉素、四环素、庆大霉素的治疗效果不佳。这与有关的报道相符[11]。药敏试验说明该菌种已经对常用的药物产生耐药性。当前在犬细菌性腹泻的治疗中常常出现乱用抗生素，或者使用了合适的抗生素却达不到良好治疗效果的现象。

3.3 犬病治疗中的误区

误区一：一泻就用止泻药。过早的服用止泻药，或者是止泻药服用不当，反而会延误病情，甚至可以导致严重的并发症。误区二：先镇痛缓解腹泻，感染性腹泻时可能会出现腹痛的现象，一些犬主则习惯给犬服用654-2、颠茄片等止痛剂，而且不按犬的的月龄，随意使用。这种做法非常不安全，因为止痛后，不让肠蠕动，会导致肠道蠕动功能瘫痪，肠音消失或减弱，容易引起肠黏膜脱落 ，便血。误区三：一泻就吃消炎药，许多人一看到犬腹泻，就使用复方新诺明或诺氟沙星等抗生素。其实这种做法是不合适的。因腹泻有感染性和非感染性两类，非感染性腹泻可由饮食不当、食物过敏、生活地域的改变、气候突变等原因引起，此类腹泻使用抗生素治疗是无效的，而应当服用一些助消化药或采用饮食疗法等。即便是感染性腹泻，在选用抗生素时，最好先做大便细菌培养，明确致病菌种类，再选用对细菌最敏感的抗生素进行治疗。切不可滥用抗生素。 误区四：泻止就停药，有的人腹泻常依症状服药，即腹泻重时多服药，腹泻轻时少服药，稍有好转就停药。这样做很容易造成治疗不彻底而使腹泻复发，或转为慢性腹泻，给治疗带来很多困难[7]。正确的使用抗生素后，就不能随便停用，否则就容易使细菌产生耐药性。

3.4 试验犬与健康犬肠道菌比较

通过对引起犬细菌性腹泻的细菌进行分离鉴定得出的结果与健康犬的常规肠道菌进行对比发现。在正常的犬肠道内存在着许多种类的细菌其中包括需氧、兼性厌氧、厌氧细菌、真菌在内的45个菌属的约164种菌。涉及菌种包括链球菌、葡萄球菌、棒状杆菌、埃希菌、双歧杆菌、拟杆菌、乳杆菌、梭菌、念珠菌、青霉菌、地霉菌、毛霉菌与链格孢霉等[13]，通过对正常犬只的大便进行培养也证明了这点。而引起这次细菌性腹泻的细菌培养后主要得到的是大肠杆菌，说明了这些犬的细菌性腹泻主要是由致病性大肠杆菌引起的。

4 结论

通过试验得到了两个结论，首先春季在昆明地区犬细菌性腹泻的原因主要是由大肠杆菌引起的。造成这种现象的原因可能是应为在春季食物容易变质，而畜主不注意犬的卫生，使犬食用了不洁的食物或水造成的。第二可能是因为经常使用抗生素的原因，这类大肠杆菌已经对一些常用的抗生素产生了耐药性，因此在平时的诊治过程中，建议使用头孢类或喹诺酮类的抗生素进行治疗。平时应该注意不要乱用抗生素，使用后不要随意停用，应该按疗程使用，不可长时间使用一种抗生素以免细菌产生耐药性。

[1] 谈永进, 赵启立, 陈晓生. 猪病原菌性腹泻及其防治[J]. 畜禽业.2009(3). 70-71.

[2] 赵辉玲. 羊的常见细菌性传染病(上)[M]. 合肥: 安徽科技出版社.2007.

[3] 马卫明, 王建坤, 王春璈等. 简明宠物疾病诊断与防治[M]. 北京:化学工业出版社, 2009.

[4] 陈天寿主编. 微生物培养基的制备与应用[M]. 北京:中国农业出版社, 1995.

[5] 姚火春主编. 兽医微生物学实验指导[M]. 北京: 中国农业出版社,2002.

[6] 陆承平主编. 兽医微生物学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2007.

[7] 王春璈主编. 简明宠物疾病诊断与防治[M]. 北京: 化学工业出版社, 2009.

[8] 陈溥言主编. 兽医传染病学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2006.

[9] 王云峰, 王翠兰, 崔尚金. 兔致病性大肠杆菌生物学的研究[J]. 中国预防兽医学报, 1999, 21(5): 334-335.

[10] 孙善发, 林凤仙, 蔡文林. 兔致病性大肠埃希氏菌分离与血清型鉴定[J]. 中国兽医杂志, 1998, 24(4): 20-21.

[11] 苗宏光, 靳兆江. 兔大肠杆菌病的诊治[J]. 河南畜牧兽医, 2000,21(4): 39-40.

[12] 阎继业主编. 畜禽药物手册[M]. 北京:金盾出版社, 2007.

[13] 林德贵. 犬肠道抗菌药物相关性菌群失调的微生物学与组织病理学研究[J]. 华中农业大学兽医外科学, 2008.