应用胶体金免疫层析法测定牛奶中的磺胺类药物残留

李海龙 （北京市昌平区动物卫生监督所 102200）

万宇平* 冯才茂 孙 震 崔廷婷 （北京勤邦生物技术有限公司）

磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，现广泛用于预防和治疗乳牛传染病[1]，并有饲料生产企业将其作为饲料添加剂，以预防病毒性疾病的发生，提高饲料转化率，促进奶牛的生长及生产性能[2]。但不合理的使用容易造成药物在牛奶中的残留，并对人体健康产生危害，如引起过敏反应、增加细菌耐药性等[3,4]。我国农业部第235号公告中已规定牛奶中总磺胺以及单个磺胺药物的最高残留限量(MRL)为100μg/kg，磺胺二甲嘧啶的MRL为25μg/kg[5]，建立快速、灵敏、准确的磺胺类药物残留检测技术非常必要。

胶体金免疫层析技术(Gold immunochromatographic assay，GICA)是近年来发展迅速的一项免疫标记技术，它以抗原抗体特异性结合为基础、大孔径微孔滤膜为载体、胶体金为固相标记物来定性检测样本中的待测物质[6]。因其快速、便捷，因此继抗生素微生物检测法[7,8]、理化分析法(高效液相色谱法[1,9]、液质联用法[10,11]、气相色谱法[12]、分光光度法[13]等)和免疫测定法(酶联免疫法[14]、放射免疫法[15]等)后，GICA分析法逐渐被广泛应用于牛奶中抗生素残留检测中[6,16,17]。本试验利用胶体金免疫层析法对牛奶中的磺胺类药物残留进行检测，为磺胺类药物的残留监控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

（1）市售牛奶、磺胺类药物快速检测试纸(北京勤邦生物技术有限公司)其中包括微孔试剂和试纸条、磺胺类药物标准品(美国Sigma公司)纯度≥99%。（2）微量移液器(单道20～200μl、100～1000μl、多道50～300μl美国Thermo公司)、Acquity液相色谱串联质谱仪配有电喷雾离子源(美国Waters公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理 使用前将待检奶样恢复至室温。(注：牛奶样品必须为均匀液体，不能有结块、发酸和沉淀)。

1.2.2 检测步骤 将原包装预先平衡至室温，打开后取出所需数目的微孔试剂和试纸条，并做好标记；用微量移液器吸取200μl待检牛奶样品溶液于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀；将标记好的试纸条插入微孔中印有“MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中；室温(20～25℃)孵育5min后，取出试纸条，判定结果。

1.2.3 结果判断 阴性(-)：C线和T线都显色，无论颜色深浅，均表示牛奶样品中磺胺类药物浓度低于检测限。阳性(+)：C线显色，T线不显色，表示牛奶样品中磺胺类药物浓度高于或等于检测限。无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效。在此情况下，应用新的试纸重新测试。

2 结果与分析

2.1 灵敏度试验

采用样品前处理方法，在空白样品中分别添加磺胺类药物标准品至一定的终浓度，然后取三批试纸条进行检测，每批测定5个重复，结果见表1，部分实验结果见图1。

由表1可知，磺胺类药物快速检测试纸条测定牛奶中磺胺类药物残留的检测限分别为：磺胺嘧啶60μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺氯哒嗪30μg/L、磺胺间二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺间甲氧嘧啶50μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺对甲氧嘧啶30μg/L、磺胺异噁唑10μg/L、磺胺甲氧哒嗪70μg/L、磺胺多辛70μg/L。

表1 灵敏度试验 (mg/L)

图1 试纸条检测限实验结果

2.2 假阳性率试验

用3个批次的磺胺类药物胶体金试纸条对50份阴性牛奶样品进行检测，结果见表2。该50份阴性牛奶样品中有1份为阳性，其余全为阴性，假阳性率为2%。

2.3 假阴性率试验

用3个批次的磺胺类药物胶体金试纸条对50份分别添加磺胺嘧啶至浓度60μg/L，磺胺二甲基嘧啶至浓度20μg/L，磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑至浓度80μg/L，磺胺氯哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶至浓度30μg/L，磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯酰至浓度50μg/L，磺胺异噁唑至浓度10μg/L、磺胺甲氧哒嗪、磺胺多辛至浓度70μg/L的阳性牛奶样品进行检测，结果见表2。该50份阳性牛奶样品的检测结果均为阳性，假阴性率为0。

2.4 特异性试验

将恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、金霉素、土霉素、强力霉素溶于pH7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，配成浓度为500μg/L的溶液，用试纸条进行检测。结果发现，C线和T线均显色，显示阴性结果，表明本试纸条对其他抗生素无交叉反应，具有较好的特异性。

表2 假阳性率、假阴性率试验

2.5 与仪器方法比较

随机抽取50份牛奶样本，用试纸条方法和国标方法《GB/T 21316—2007 动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》分别进行检测。结果筛选出3份阳性样本，试纸条结果均为C线显示出红色条带，T线不显色；仪器结果分别为105.2μg/L、180.7μg/L和110.3μg/L。可见，GICA法和LC-MS/MS法测定结果基本一致，符合度达到100%，适用于牛奶样本中磺胺类药物残留的检测。

3 结论

本研究采用胶体金免疫层析法对牛奶中的磺胺类药物残留进行检测，检测限分别为磺胺嘧啶60μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺氯哒嗪30μg/L、磺胺间二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺间甲氧嘧啶50μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺对甲氧嘧啶30μg/L、磺胺异噁唑10μg/L、磺胺甲氧哒嗪70μg/L、磺胺多辛70μg/L，检测阴、阳性样本时，假阳性率为2%，假阴性率为0；对其他抗生素无交叉反应，特异性较好；与液相色谱-质谱/质谱法相比，检测结果一致，符合度达到100%。

本研究所使用的胶体金试纸条是在传统的试纸条基础上进行了改进。将胶体金标记的抗体直接冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度，易于对样品中的药物残留情况进行分析；同时，摈弃了传统试纸条的塑料卡壳，仅以“裸条”形式装于试剂桶中，节约空间，减少生产和运输成本。尽管结构的改进提高了试纸条的灵敏度，但由于通过颜色判断结果比较主观，可能出现假阳性问题，因此对于阳性样本，还需要用LC-MS/MS等仪器方法进行确证。

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