NF-κB、MMP-9在宫颈癌细胞中的表达及意义

杜晓晋 吴素慧 尚海霞

宫颈癌是女性妇科恶性肿瘤之一，其发病机制尚不清楚，临床多伴有淋巴结转移，且易复发，严重威胁着妇女的健康和生命。核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一种重要的核转录因子，其激活后参与调节多种细胞因子、粘附因子的表达，在炎症、肿瘤等疾病的发生发展中起重要作用[1]。MMP-9在多种恶性肿瘤中表达增高，有研究发现，NF-κB在乳腺癌中参与MMP-9的转移及侵袭[2]。目前宫颈癌中NF-κB与MMP-9关系的研究尚未多见，本研究检测NF-κB和MMP-9在两种宫颈癌细胞中的表达，揭示NF-κB、MMP-9在宫颈癌发生发展及转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 兔抗人NF-κB多克隆抗体购自北京博奥森生物工程有限公司，兔抗人MMP-9多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，NF-κB酶联免疫吸附试验试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，MMP-9酶联免疫吸附试验试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物公司。宫颈癌细胞株siha和caski均购自武汉博士德生物工程有限公司。在37℃条件下，5% CO2恒温培养箱内培养，所用的培养液MEM、RPMI-1640均含10%的胎牛血清、青霉素、链霉素（各1U/ml），实验细胞均处于对数生长期。

1.2 免疫细胞化学检测NF-κB、MMP-9在两种宫颈癌细胞中的表达 取对数生长期细胞，经胰蛋白酶消化后，将细胞密度为1×105的细胞悬液接种于装有盖玻片的6孔板中，常规培养，制备细胞爬片，细胞爬片用PBS洗5min×3次，4%多聚甲醛固定30min后，PBS洗3min×3次，采用SP法检测NF-κB、MMP-9的蛋白表达，一抗浓度均为1:50。采用NF-κBp65蛋白染色以细胞质和(或)细胞核呈棕黄色为阳性表达，MMP-9阳性细胞均表现为细胞质或细胞膜内含棕黄色颗粒，根据染色强度测定平均灰度值进行分析。

1.3 ELISA法检测NF-κB、MMP-9在两种宫颈癌细胞上清液中的表达 实验步骤严格按试剂盒说明中的操作步骤进行，用酶标仪在450nm处测吸光值（OD），根据样品的OD值在坐标上找出相对应的浓度。

1.4 统计学方法 实验结果采用SPSS17.0统计软件处理，实验数据以±s表示，计量资料两组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌细胞中NF-κB、MMP-9蛋白的表达（见表1） 免疫细胞化学方法结果表明，NF-κB在宫颈癌细胞中主要表达于细胞质和/或细胞核，与siha细胞相比，在转移性的宫颈癌caski细胞中表达较高，差异有统计学意（P＜0.01）。MMP-9在癌细胞中主要表达于细胞质或细胞膜，且在caski细胞中表达较siha细胞高，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 NF-κB、MMP-9在两种宫颈癌细胞中的表达（±s）

表1 NF-κB、MMP-9在两种宫颈癌细胞中的表达（±s）

细胞因子 siha细胞 caski细胞 P值NF-κB 141.35±5.27 110.62±3.79 0.000 MMP-9 139.85±3.41 108.29±6.52 0.000

2.2 宫颈癌细胞上清液中NF-κB、MMP-9蛋白表达（见表2） ELISA法结果显示，NF-κB、MMP-9在两种宫颈癌细胞中均有表达，与siha细胞比较，在转移的caski细胞中表达较高，差异有统计学意义（P＜0.01）。提示宫颈癌细胞可以分泌NF-κB、MMP-9，且在转移的细胞中分泌增加。

表2 NF-κB、MMP-9在两种宫颈癌细胞上清液中的表达（±s）

表2 NF-κB、MMP-9在两种宫颈癌细胞上清液中的表达（±s）

细胞因子 siha细胞 caski细胞 P值NF-κB 62.47±3.69 93.14±3.26 0.000 MMP-9 67.58±4.52 96.85±4.72 0.000

3 讨论

NF-κB是一种多功能细胞核转录因子，经典形式是由p50/p65组成的异源二聚体，在正常情况下，与其抑制物I-κB蛋白结合，以无活性形式存在于细胞质中。当细胞中NF-κB受到外界刺激后被激活，活化的p50/p65进入到细胞核中，启动或调节多种细胞因子的表达及转录，如Cyclin D1,Bcl-2,MMP-9等[3]。研究发现，在肝癌[4]、乳腺癌[5]等多种肿瘤中有NF-κB的异常表达及激活，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。并认为NF-κB可能通过调控细胞生长增殖、凋亡及转移的相关基因表达,促进恶性肿瘤的发展[6]。田卫红等[7]研究发现，NF-κB的亚单位p50和p65在宫颈癌细胞系中存在表达，并证实激活的p50、p65具有与DNA结合并促进转录的能力且存在mRNA的表达。这与我们的研究是一致的，本实验中，通过免疫细胞化学和ELISA方法检测发现，NF-κB在不同宫颈癌细胞株中均有阳性表达，主要表达在细胞质和细胞核，表明宫颈癌细胞中不仅有NF-κB的表达而且存在激活，其在转移的caski细胞中表达较siha细胞高，差异有统计学意义（P＜0.01），提示NF-κB在宫颈癌的发生发展中起着重要作用。

MMP-9是人类基质金属蛋白酶(MMPs)家族成员中重要的酶系，参与Ⅰ型及Ⅳ型胶原和细胞外基质（ECM）的降解，人类MMP-9启动子含有顺式作用元件和转录因子结合位点，包括NF-κB（-600bp）和AP-1(-533bp,-79bp)的结合位点，这些因子参与MMP-9的基因转录。研究显示，Yoonseo Kim[2]等利用南蛇藤素抑制NF-κB的活性，进而抑制MMP-9基因的表达，从而降低人类乳腺癌细胞MCF-7的转移及侵袭。本实验中,通过免疫细胞化学法和ELISA法检测发现，MMP-9蛋白在不同宫颈癌细胞株中呈现阳性表达，与siha细胞比较，在转移的caski细胞中表达较高，差异有统计学意义（P＜0.01）。提示MMP-9在促进宫颈癌浸润转移中起重要作用，表明NF-κB信号通路的激活与其下游调控基因MMP-9的表达有着密切的关系，二者协同作用共同促进宫颈癌的发生、发展及浸润转移。

总之，NF-κB在不同的宫颈癌细胞中不仅有表达且存在激活，活化的NF-κB可调控其下游靶基因MMP-9的表达，进而促进肿瘤细胞的浸润转移。由于NF-κB在肿瘤的发生发展及促进浸润转移中起着重要的作用,因此阻断NF-κB和MMP-9可作为基因治疗的的靶点。

[1]Aggarwal BB.Nuclear factor-kappa B:the enemy with in [J].Cancer Cell, 2004,6(3):203-208.

[2]Yoonseo Kim.Celastrol inhibits Breast Cancer Cell Invasion via Suppression of NF-κB-mediated MatrixMetalloproteinase-9 Expression. Cell Physiol Biochem，2011,28:175-184。

[3]Dolcet X,Llobet D,Pallares J,et al.NF-kB in development and progression of human cancer[J].VirchowsArch,2005,446(5):475-475.

[4]Qiao L, Yu J,Dent P,et al.NF-kappa B protects ratARL-6 hepato cellular carcinoma cells against hydrogen peroxide induced apoptosis[J].Cancer Biol Ther,2005,4(11):1195-1195.

[5]Sovak MA,Bellas RE,Kim DW.Aberrant nuclear factor -κB/R el expression and the pathogenesis of breast cancer[J].J Clin Invest,1997,100(12):2952-2960.

[6]Suh J,Rabson AB.NF-kappa B activation in human prostate cancer:important mediator or epiphenomenon[J].Cell Biochem,2004,91(1):100-117.

[7]田卫红,田芳,许培荣,等.HeLa细胞系中核转录因子-κB与Bcl-2的表达[J].郑州大学学报:医学版,2009,44(1):74-77.