嗜热链球菌的分离鉴定及牛乳样中抗菌药物残留的检测

李增魁，黄文明，卓 玛

（1.青海大学农牧学院，青海西宁810016；2.青海省同德县动物疫病预防控制中心，青海同德813200；3.青海省同德县巴沟乡兽医站，青海同德813200）

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，ST）属于异常球菌科链球菌属的革兰阳性菌，在伯杰细菌鉴定手册中分成六类，其自然栖息地不详，但在热及低温杀菌的乳制品中能发现该菌的存在［1］。该菌无致病力，在人体内能够耐受胃酸和胆盐，并且可抑制肠道致病菌，又能产生胞外多糖、细菌素和维生素等活性物质，被认为是一种多功能益生菌，常作为制造乳制品的重要原料。因此，嗜热链球菌在乳制品工业中扮演着非常重要的角色。嗜热链球菌在37℃环境下生长良好，耐高温，在60℃下可存活，能在45℃乳中快速生长，籍此特性可与同属其他细菌相鉴别［2］。从生化特性上来看，嗜热链球菌发酵乳糖、蔗糖，也能发酵果糖、甘露糖、葡萄糖及乳糖使其产酸。

当前，全世界细菌耐药性已伴随着抗生素的广泛使用而越来越严重，除了致病菌的耐药问题，益生菌菌株和抗生素同时服用时，虽能帮助宿主恢复肠道菌群平衡［3］，使益生菌在肠道存活，但人和动物体内的益生菌一旦产生耐药性后，其耐药基因有可能在肠道内菌群之间相互传递［4］，从而导致某些致病菌也获得耐药性。因此，益生菌的安全性应受到更多的关注。

由于抗生素残留的危害［5］，我国规定按国家标准［6］生产的鲜牛乳中不得检出抗生素［7］。嗜热链球菌因在牛乳中生长时可将无色的2，3，5－氯化三苯基四氮唑（2，3，5－triphenyltetrazolium chloride，TTC）还原为红色的三苯甲瓒而作为指示菌，如果嗜热链球菌产生耐药性，则会对牛乳中抗生素残留的检测结果产生影响。因此，从乳制品中分离嗜热链球菌，对其耐药性进行了测定，再用分离到的嗜热链球菌作为指示菌对牛乳中抗生素的残留进行了检测，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检样与药品 纯牛奶，购自西宁不同品牌、不同包装的纯牛奶13份（编号为No.1～13）和散装奶44份（编号为No.14～57）作为检测样品；嗜热乳酸链球菌分离于某品牌酸奶；TTC（2，3，5－氯化三苯四氮唑）购于北京经科宏达生物技术有限公司；注射用青霉素钠，提供生产商。

1.1.2 试验菌株 嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，ST）由市售某品牌酸奶中分离。

1.1.3 培养基 BCG牛乳培养基、乳酸菌葡萄糖发酵培养基、牛乳培养基、MH培养基等。

1.1.3.1 BCG 牛乳培养基 A 溶液：脱脂乳粉20g，水100mL，加入16g／L溴甲酚紫乙醇溶液0.2mL，80℃灭菌20min；B溶液：酵母膏2g，水100mL，琼脂4g，121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将A、B溶液混合均匀后倒入8个平板。

1.1.3.2 乳酸菌葡萄糖发酵培养基 蛋白胨0.5g，牛 肉 膏 0.5g，酵 母 膏 0.5g，吐 温－80 0.05mL，葡萄糖1g，蒸馏水100mL，加入16g／L溴甲酚紫溶液约0.14mL。以上成分溶解后调pH到6.8～7.0，分装到10只试管中。每只试管里再放置一支德拉姆氏小管。105℃湿热灭菌15min。

1.1.3.3 牛乳培养基 12g全脂奶粉，加水100mL，加入10g葡萄糖，溶解后分装，105℃灭菌15min，取出备用。

1.1.3.4 MH培养基 MH培养购于杭州天和微生物有限责任公司，称取42.0g成品培养基溶解于1 000mL蒸馏水中，倒入锥形瓶中加盖，121℃湿热灭菌20min。

1.1.4 药敏纸片 28种药敏纸片（批号为ws／T125－1999），购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理及嗜热链球菌的分离

1.2.1.1 样品处理 取酸奶10mL加入90mL无菌生理盐水，充分混匀。从三角瓶吸取1mL菌液，加入9mL无菌生理盐水试管中。依次倍比稀释。

1.2.1.2 培养 将新鲜酸奶采用稀释平板涂布于BCG牛乳培养基平板上，稀释菌液置于冰箱中备用，平板置于培养箱37℃±1℃中培养2d～3d。

1.2.1.3 分离纯化 挑取单菌落，用划线法于BCG牛乳培养基分离纯化，置于37℃培养箱培养。

1.2.2 嗜热链球菌的鉴定

1.2.2.1 菌种的革兰染色和形态观察 将分离的纯菌种接种在BCG牛乳培养基上，40℃培养28h，用无菌接种环取一环菌均匀涂布在滴有无菌水的载玻片上，自然风干。固定后进行革兰染色。染色后用显微镜油镜进行观察。

1.2.2.2 生化鉴定 分别取可疑菌落接种到葡萄糖、木糖、七叶苷、侧金盏花醇、棉籽糖、甘露糖、纤维二糖、β－半乳糖苷、山梨醇、明胶、阿拉伯糖、乳糖的发酵试管中，并将其置于37℃培养箱中培养48h后观察。

1.2.3 嗜热链球菌的益生性

1.2.3.1 耐热性试验 将纯化菌株接入糖发酵基础培养基中，37℃恒温培养并观察其颜色变化。将纯化菌株接入BCG培养基中，分别在15℃和45℃恒温培养2d～3d，观察菌株生长情况。将奶粉配成浓度120g／L的溶液，分装试管，80℃杀菌30min，冷却接入纯化菌株，37℃恒温培养并观察其凝乳情况。

1.2.3.2 牛奶发酵试验 将分离的纯菌种活化后，以2%的接种量接入牛乳培养基中，摇匀后，将瓶盖拧紧密封。将三角瓶置于40℃恒温箱中培养，出现凝固后转入4℃冰箱中冷藏24h。

1.2.4 药敏试验 吸取1mL浓度为1×108cfu／mL的菌悬液于15mL MH培养基（40℃～50℃）中，混和均匀后倾注到平皿中，待琼脂表面凝固后取药敏纸片贴于琼脂表面，每个培养皿贴4张间隔均匀适中的同种药物纸片，静置5min后翻转平皿，于37℃恒温培养，48h后测量并记录抑菌圈的直径。

1.2.5 抗生素残留的检测方法

1.2.5.1 样品检测 取待检样液9mL，在80℃水浴加热5min后冷却到37℃以下，加活菌液1mL，在36℃±1℃水浴2h，加入4%的TTC指示剂0.3mL，36℃±1℃ 水浴培养30min。

1.2.5.2 试验结果判断 被检牛乳中如果有抗生素残留，则加入的嗜热链球菌被抑制，因此，氯化三苯基四氮唑被还原，所以不显色，结果呈阳性。相反，被检牛乳中如果没有抗生素残留，加入的嗜热链球菌则进行增殖，氯化三苯基四氮唑被还原而显红色，结果呈阴性。

1.2.5.3 试验结果观察 如为阳性，再水浴培养30min做第2次观察。每份检样做2份，另外再做阴性、阳性对照各1份，阳性对照管用无抗生素的乳8mL加抗生素及菌液和TTC。阴性对照管用无抗生素乳9mL加菌液和TTC。

2 结果

2.1 嗜热链球菌的分离与纯化的结果

稀释酸奶并涂布于BCG牛乳培养基平板上培养48h后，观察到黄色、扁平、边缘不整齐的菌落。

2.2 分离菌的革兰染色及形态观察

分离菌革兰染色呈蓝紫色，菌体呈球形或卵圆形的球菌，排列成长短不等的链状。

2.3 生化鉴定结果

葡萄糖、七叶苷、乳糖、甘露醇、明胶产酸变色，鉴定为阳性，阿拉伯糖、β－半乳糖苷、棉籽糖、纤维二糖、山梨醇、侧金盏花醇为阴性。通过与《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌的分类鉴定与实验方法》对照，可鉴定其为嗜热乳酸链球菌（表1）。

2.4 耐热性试验结果

分离菌接种于BCG牛乳培养基上，分别在15℃、45℃的环境中培养，均可观察到菌落的生长。

2.5 分离菌株的牛奶发酵结果

将分离菌株活化后接入灭菌的牛乳培养基中进行了牛奶发酵，酸奶的组织状态细腻；4.6h凝乳且均匀，有少量乳清析出；品尝无异味，脂香味浓；pH 5.2。

2.6 药敏试验结果

因国内还没有提供针对非致病乳酸细菌的药敏标准［8］，所以我们列出了分离到的嗜热链球菌对28种抗生素在MH培养基上的抑菌圈直径，供其他研究者参考。分离菌对氨苄西林（AMP）的抑菌圈直径为0mm，即耐药；分离菌对青霉素G（PV）、红霉素（ERY）的抑菌圈小，分别为8mm、9mm（表2）。

2.7 抗菌药物残留检测结果

从表3可以看出，抽检某品牌牛乳13份，检出抗菌药物残留阳性乳样7份，阳性率53.8%，可疑乳样1份，可疑率7.69%；抽检散装乳44份，检出抗生素残留阳性乳样5份，阳性率11.36%，可疑乳样1份，可疑率2.27%。抽检乳样抗生素残留总阳性率为21.05%，可疑率为3.51%。

表1 试验菌株的生化试验结果Table 1 The results of the biochemistry test of the isolated bacteria

表2 分离细菌药敏试验结果Table 2 The drug susceptibility tests of the isolated bacteria

表3 不同牛乳样的抗菌药物残留检测结果Table 3 The drug residue results of 57different milk samples detected by TTC method

3 讨论

BCG牛乳培养基中因有指示剂溴甲酚紫，有嗜热链球菌生长时菌落颜色为黄色，加之嗜热链球菌在45℃依然生长，易与其他菌鉴别。革兰染色、形态观察可对分离到的菌株进行简单鉴定。但在对嗜热链球菌菌株因培养时间的长短、培养温度的波动、培养基的厚薄，其菌落形态有所差异。因此，生化鉴定虽难达到菌株水平的鉴定要求［1］，但它是鉴定微生物的常用方法。

目前国内药敏试验结果的判定没有提供针对非致病乳酸细菌的药敏标准［8］。有学者认为乳酸菌几乎不能在MH（NCCLS推荐）培养基上生长［9］。但在本次试验中采用倾注接种法，嗜热链球菌在MH培养基中生长良好，形成的抑菌圈清晰，可得到满意药敏试验结果；培养时间的长短也对抑菌圈直径影响不大。

从这次的药物敏感试验结果来看，嗜热链球菌对绝大部分抗生素都敏感，却对氨苄西林（AMP）耐药（抑菌圈直径为0mm）。用本次分离的嗜热链球菌作为指示菌用于TTC法检测牛乳中抗生素的残留，如果牛乳中残留有β－内酰胺类抗生素，则有可能无法检出。鉴于TTC法的缺陷和不足，需要开发更为快速、灵敏、准确的抗生素残留分析方法。

本次试验对西宁地区牛乳中的抗生素残留调查只采用了TTC法，对具体的残留品种及残留量没有检测，但仅从21.05%（12／57）的阳性率来看，与“无公害食品标准的抗生素残留不得检出”的要求还有很大差距。要解决牛乳安全的问题，应从源头上来控制抗生素的残留［10］。

［1］ 布坎南R E，吉本期N E.伯杰氏细菌鉴定手册［M］.8版.北京：科学技术出版社，1984.

［2］ Bernard W H，Frederick J B.Dairy bacteriology［M］.4th edition.New York：John Wiley and Sons Inc，1984.

［3］ Madden J A J，Plummer S F，Tang J，et al.Effect of probiotics on preventing disruption of the intestinal microflora following antibiotic therapy：a double－blind，placebo－controlled pilot study［J］.Int Immunopharmacol，2005，5（6）：1091－1097.

［4］ Saarela M，Mogensen G，Fonden R，et al.Probiotic bacteria：safety，functional and technological properties［J］.J Biotechnol，2000，84：197－215.

［5］ 陈怀宇，黄周英，林育腾.牛乳中抗生素的残留与危害现状［J］.泉州师范学院学报，2004，22（6）：102－106.

［6］ 食品卫生微生物学检验·鲜乳中抗生素残留量检验［S］.中华人民共和国国家标准，GB／T 4789.27－2003.

［7］ 无公害食品 生鲜牛乳［S］.中华人民共和国农业部行业标准，NY 5045－2008.

［8］ Masco L，Van Hoorde K，De Brandt E，et al.Antimicrobial susceptibility of Bifidobacteriumstrains from humans，animals and probiotic products［J］.J Antimicrob Chemother，2006，58（1）：85－94.

［9］ 冯大伟，周家春.益生乳酸菌的纸片扩散法药敏性试验评价［J］.微生物学通报，2010，37（3）：454－464.

［10］ 高世涛，宋卫东.加强奶源管理正确使用有效检测实现牛奶抗生素残留达到安全极限［J］.中国乳业，2002，（11）：12－14.