宁夏部分地区奶牛乳腺炎病原菌的分离鉴定

王 东，李发万，王旭青，王建波，蒲建明，丁林军，刘军红，扈登强

（1.宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏银川750021；2.银川市动物卫生监督所，宁夏银川750001；3.宁夏大学外国语学院，宁夏银川750021；4.银川市农业局，宁夏银川750001；5.吴忠市畜牧局，宁夏吴忠751100；6.宁夏博奥药业有限公司，宁夏银川750021）

奶牛乳腺炎是乳房受到物理、化学、微生物等因素的刺激所发生的一种炎性变化，其特点是乳房中体细胞增多以及乳腺组织发生病理变化［1］。奶牛乳腺炎不仅降低产奶量，影响牛奶的品质，造成奶产业的经济损失，而且影响食品卫生和人类健康，是目前危害奶牛业的主要疾病之一。引起奶牛乳腺炎的微生物种类繁多，如细菌、病毒、真菌、支原体等［2－3］，已报道从乳房炎的乳汁中分离130多种微生物，较常见的有20多种，其中以细菌较为常见，主要的致病菌是葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌，约占90%以上［4－5］，但不同地区奶牛乳房炎的细菌分布和种类有一定差异［6－8］。为了解宁夏地区奶牛乳腺炎的发病情况及病原菌的种类和分布状况，进行了奶牛乳腺炎病原菌的分离和鉴定工作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 奶样 327份奶样采自宁夏银川市、吴忠市、石嘴山市、中卫市4个市的9个县（区）的16个规模化牛场的泌乳期奶牛。

1.1.2 培养基及试剂 营养琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、三糖铁琼脂、高盐甘露醇琼脂、沙保罗液体培养基、沙保罗琼脂等购自杭州天和微生物试剂有限公司；蛋白胨、酵母粉购自北京双旋微生物培养基制品厂；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；兰州隐性乳房炎诊断液购自中国农科院兰州畜牧与兽药研究所；葡萄球菌属细菌生化鉴定管、链球菌细菌生化编码鉴定管、肠杆菌科细菌生化常规鉴定管、酵母样真菌生化鉴定管均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 隐性乳腺炎检测 按常规方法清洗和消毒泌乳牛乳区，每个乳区取奶样2 mL注入检验盘中，加入2 mL兰州隐性乳房炎诊断液，作同心圆摇动，10 s后根据凝集反应程度进行判定。混合液均匀，流动性好，无絮状物（－）；有少许絮状物或沉淀产生（弱阳性＋）；有明显絮状物或沉淀（阳性＋＋）；絮状物或沉淀聚集成凝胶状（强阳性＋＋＋）。检测结果在两个“＋”以上视为隐性乳腺炎病例［8－9］。

1.2.2 奶样采集 奶样来自于患乳腺炎的病牛（隐性乳腺炎检测呈阳性或临床型）。先用温水清洗乳房，然后用1 mL／L新洁尔灭溶液擦洗，再用750 mL／L酒精棉球消毒乳头。每个乳头先弃去前3把奶，然后以无菌操作的方法从每个乳区分别采集5 mL～10 mL奶样，置于经高压灭菌的玻璃试管中，标明采样牛场、牛号和日期，在冷藏条件下送实验室做病原学检查［6－7］。

1.2.3 病原菌分离培养 将试管中采集的奶样摇匀后，接种血清肉汤培养基，37℃温箱培养24 h～48 h；待培养基变混浊后分别接种营养琼脂、绵羊鲜血琼脂、高盐甘露醇琼脂、沙保罗琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂和三糖铁琼脂培养基，37℃温箱培养24 h～48 h，观察菌落形态特征和溶血性，挑选单个菌落进行涂片、革兰染色、镜检［6－8］。

1.2.4 病原菌鉴定

1.2.4.1 形态学鉴定 根据病原菌在各种培养基中的生长情况、菌落形态特征、溶血性及涂片镜检结果，将所分离的细菌初步分为葡萄球菌、链球菌、酵母菌、革兰阳性杆菌、革兰阴性杆菌［10－11］。

1.2.4.2 凝固酶试验 挑取葡萄球菌菌苔，混悬于1∶4倍稀释的兔血浆0.5 mL中，制成菌悬液，37℃培养2 h～4 h，凝固者为阳性［10］。

1.2.4.3 触酶试验 取1滴30 mL／L的过氧化氢，放在玻片上，然后挑取固体培养基上典型菌落，加到玻片上与试剂混合，如有大量气泡者为阳性反应［10］。

1.2.4.4 CAMP试验 取能产生β溶血的葡萄球菌液，沿平板中央画直线接种绵羊鲜血琼脂培养基，再取待检链球菌菌液与葡萄球菌划线垂直的方向划直线接种，37℃培养24 h～48 h，能使绵羊红血球呈箭头状溶血者为CAMP试验阳性［10］。

1.2.4.5 生化鉴定 根据分离菌的培养特性、染色特点和形态特征，将初步筛选符合葡萄球菌、链球菌、肠杆菌、酵母样真菌的培养物分别接种于葡萄球菌属细菌生化鉴定管、链球菌细菌生化编码鉴定管、肠杆菌科细菌生化常规鉴定管、酵母样真菌生化鉴定管中，进行生化特性鉴定［10－11］。

2 结果

2.1 病原菌主要特性

2.1.1 金黄色葡萄球菌 在营养琼脂培养基上生长良好，在鲜血琼脂培养基上形成金黄色湿润、光滑、隆起的中等大小菌落，有溶血现象；染色镜检形态一致，呈葡萄球状，革兰阳性；凝固酶试验和触酶试验均为阳性。

2.1.2 凝固酶阴性葡萄球菌 在营养琼脂培养基上和鲜血琼脂培养基生长良好；染色镜检形态一致，呈葡萄球状，革兰阳性；凝固酶试验为阴性，触酶试验为阳性。

2.1.3 链球菌 在营养琼脂平皿上生长不良，鲜血平皿上生长较好，菌落为露滴状，圆形、隆起、半透明，呈α或β溶血；染色镜检形态一致，成双或短链状、长链状排列；凝固酶试验和触酶试验均为阴性。无乳链球菌不水解七叶苷和马尿酸钠，CAMP试验阳性；停乳链球菌不水解七叶苷和马尿酸钠，CAMP试验阴性；乳房链球菌水解七叶苷和马尿酸钠，CAMP试验阴性。

2.1.4 大肠埃希菌 在营养琼脂平皿和鲜血平皿上生长出灰色或灰白色大菌落；在伊红美蓝平皿上为黑色带有金属光泽菌落；在三糖铁培养基上斜面和底部均为黄色；在麦康凯平皿上呈红色菌落；染色镜检为短杆状革兰阴性菌。

2.1.5 芽胞杆菌 在营养平板和鲜血平板上为灰红色或灰白色，锯齿边缘，纽扣状、菜花状，α或β溶血，革兰染色为短杆状，有明显的芽孢。

2.1.6 酵母菌 在沙保罗琼脂上为乳白色、圆形菌落，表面光滑。革兰染色镜检，可见卵圆形或瓜子形的革兰阳性菌。

2.2 乳样细菌学检出情况

采集宁夏4市9个县（区）16个规模化牛场的327份乳样，接种细菌学培养基后，有226份乳样分离出细菌，细菌检出率69.11%。在检出细菌的226份乳样中，检出1种细菌的乳样192份，占84.96%（192／226）；检出 2种以上细菌的乳样 34 份，占15.04%（34／226）。

2.3 乳腺炎病原菌分离和鉴定

从检出细菌的乳样中，分离和鉴定出5大类细菌260株，其中葡萄球菌检出率最高，占42.31%（110／260）；其次为链球菌，占21.54%（56／260）；革兰阳性杆菌占17.31%（45／260）；革兰阴性杆菌占15.77%（41／260）；酵母菌占3.08%（8／260）（表1）。

表1 奶牛乳腺炎主要病原菌分离和鉴定结果Table1 Results of isolation and identification of mastitis pathogens in dairy cows

从分离的5大类细菌中鉴定出9种主要病原菌，宁夏地区奶牛乳腺炎主要病原菌为凝固酶阴性葡萄球菌（28.08%），停乳链球菌（15.38%），金黄色葡萄球菌（14.23%），大肠埃希菌（10.38%）。奶牛乳腺炎主要病原菌分离和鉴定结果见表1。

2.4 临床型乳腺炎病原菌分离结果

临床型乳腺炎主要病原菌分离和鉴定结果见表2。从临床型乳腺炎乳样中，分离和鉴定各类细菌39株，其中主要病原菌为酵母菌（20.51%），凝固酶阴性葡萄球菌（17.95%），金黄色葡萄球菌（12.82%），停乳链球菌（12.82%），大肠埃希菌（12.82%）。

表2 奶牛临床型乳腺炎主要病原菌分离和鉴定结果Table2 Results of isolation and identification of the clinical mastitis pathogens in dairy cows

2.5 隐性乳腺炎病原菌分离结果

隐性乳腺炎主要病原菌分离和鉴定结果见表3。从检测的隐性乳腺炎乳样中，分离和鉴定各类细菌221株，其主要病原菌为凝固酶阴性葡萄球菌（29.86%）、停乳链球菌（15.84%）、金黄色葡萄球菌（14.48%）和大肠埃希菌（9.95%）。

表3 奶牛隐性乳腺炎主要病原菌分离和鉴定结果Table3 Results of isolation and identification of the subclinical mastitis pathogens in dairy cows

3 讨论

从宁夏9个县（区）的16个规模化牛场采集327份乳腺炎奶牛乳样，通过分离培养和生化试验，检出含细菌乳样226份，乳样细菌检出率69.11%（226／327）；鉴定奶牛乳腺炎病原菌5大类9种260株，确认宁夏地区奶牛乳腺炎主要病原菌为凝固酶阴性葡萄球菌，停乳链球菌，金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌。本研究初步查明宁夏地区奶牛乳腺炎病原菌的种类和分布状况，为宁夏地区奶牛乳房炎的防治工作提供科学依据。

本研究从宁夏奶牛主要养殖地区采集327份患乳腺炎的病牛乳样，检出含细菌乳样226份，细菌检出率 69.11%（226／327），低于李桐［6］细菌分离率94.81%和宋华容细菌分离率90%的报道。在检出细菌的226份［8］乳样中，单一细菌感染乳样占84.96%（192／226），混合感染乳样占15.04%（34／226），说明由单一病原菌引起的乳腺炎较为普遍，而混合感染仅占较少比例。这与尹柏双［7］和梁建光等［12］的报道相似。

奶牛乳腺炎是由病原微生物侵入乳腺组织所产生的一种炎症反应，尽管引起奶牛乳腺炎的病原微生物种类繁多，但是据文献报道，奶牛乳腺炎的病原微生物主要以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠埃希菌为主，约占90%以上［4－5］。本试验从患乳腺炎病牛乳样中分离和鉴定出5大类细菌260株，其中葡萄球菌检出率最高，占42.31%（110／260）；其次为链球 菌，占 21.54% （56／260）；革 兰 阳 性 杆 菌 占17.31%（45／260）；革兰阴性杆菌占15.77%（41／260）；酵母菌占3.08%（8／260）。从分离的5大类细菌中鉴定出9种主要病原菌，分别为金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、大肠埃希菌、其他革兰阴性杆菌、芽胞杆菌和酵母菌，其中凝固酶阴性葡萄球菌占28.08%，停乳链球菌占15.38%，金黄色葡萄球菌占14.23%，大肠埃希菌占10.38%，这4种细菌占分离菌总数的68.08%（177／260），是宁夏地区奶牛乳腺炎的主要病原菌。

奶牛乳腺炎包括临床型乳腺炎和隐性乳腺炎。本试验对宁夏地区临床型乳腺炎和隐性乳腺炎的病牛乳样进行病原菌分离和鉴定，两种类型乳腺炎的病原菌种类和细菌分布有一定差异。临床型乳腺炎的主要病原菌为酵母菌（20.51%），凝固酶阴性葡萄球菌（17.95%），金黄色葡萄球菌（12.82%），停乳链球菌（12.82%），大肠埃希菌（12.82%）；隐性乳腺炎的主要病原菌为凝固酶阴性葡萄球菌（29.86%），停乳链球菌（15.84%），金黄色葡萄球菌（14.48%），大肠埃希菌（9.95%）。两种类型乳腺炎病原学检查结果的显著特点之一为从临床型乳腺炎病例中分离到酵母菌，并且所占比例最高，这与高玉君等［13］和韩春杨等［14］报道相似。追踪检出酵母菌病牛的流行病学资料后发现，这些病牛普遍病程较长，经过多次抗生素和中药治疗，治疗效果不显著，因此，酵母菌可能通过污染的灌注导管、注射器、针头等途径，跟随多次乳房药物灌注医源性进入乳房。由于酵母菌对一般抗生素不敏感，对于该病的治疗，应通过药敏试验，筛选高效、敏感的抗真菌药物，应用于临床治疗，才能取得预期治疗效果。

从临床型乳腺炎和隐性乳腺炎病牛乳样中同时分离到凝固酶阴性葡萄球菌，是本次乳腺炎病原学检测结果的另一个显著特点。凝固酶阴性葡萄球菌在隐性乳腺炎各类病原菌中所占比例最高（29.86%），明显高于停乳链球菌（15.84%），金黄色葡萄球菌（14.48%），大肠埃希菌（9.95%）；在临床型乳腺炎中，凝固酶阴性葡萄球菌（17.95%）所占比例仅低于酵母菌（20.51%），但高于金黄色葡萄球菌（12.82%），停乳链球菌 （12.82%），大肠埃希菌（12.82%），说明凝固酶阴性葡萄球菌是引起宁夏地区奶牛乳腺炎的主要病原菌，应该给予足够的关注。这一试验结果与马保臣［15］和何挺等［16］的报道相似。

［1］肖定汉.奶牛疾病监控［M］.北京：中国农业大学出版社，1994.

［2］Watts J L.Etiological agents of bovine mastitis［J］.Vet Microbiol，1988，16（1）：41－66.

［3］Janr R，Patrarc S.Bovine protothecal mastitis：a review［J］.Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources，2006，17（1）：1－7.

［4］Aarestrup F M，Jensen N E.Prevalence and duration of intramammary infection in Danish heifers during the peripartum period［J］.J Dairy Sci，1997，80：307－312.

［5］Pitkala A，Haveri M，Pyorala S，et al.Bovine mastitis in Finland 2001 prevalence，distribution of bacteria，and antimicrobial resistance［J］.J Dairy Sci，2004，87（8）：2433－2441.

［6］李 桐，刘 鑫，张裕琪，等.包头地区临床型奶牛乳腺炎病原菌的分离与鉴定［J］.动物医学进展，2009，30（7）：115－119.

［7］尹柏双，王洪斌，高 利.吉林地区奶牛乳房炎病原菌分离鉴定与药敏试验［J］.中国兽医杂志，2011，47（6）：37－38.

［8］宋华容，李正国，罗瑞卿，等.石河子地区奶牛乳房炎病原菌分离鉴定及中药抑菌试验［J］.安徽农业科学，2009，37（9）：4044－4047.

［9］张志英.包头地区奶牛乳房炎发病率的调查研究［J］.畜牧兽医科技信息，2007，（5）：26－28.

［10］曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术［M］.北京：北京农业大学出版社，1992：5.

［11］甘肃农业大学.兽医微生物学［M］.北京：农业出版社，1980：7.

［12］梁建光，刘 锋，孙晓智，等.呼和浩特地区不同养殖模式下引起奶牛隐性乳房炎的主要致病菌［J］.中国奶牛，2011，（8）：42－45.

［13］高玉君，周建胜，马慧玲，等.泰安市奶牛乳腺炎调查及病原菌分离鉴定［J］.食品与药品，2005，7（9）：53－55.

［14］韩春杨，冯士彬，刘翠艳，等.奶牛临床型乳房炎病原菌分离鉴定及药敏试验研究［J］.中国奶牛，2010，（7）：38－40.

［15］马保臣.奶牛乳腺炎病因学和金黄色葡萄球菌的分子调查及Fnbp蛋白免疫［D］.山东泰安：山东农业大学，2006：6.

［16］何 挺.奶牛乳腺炎主要病原菌的调查［D］.浙江杭州：浙江大学，2010：5.