慢性环孢素肾病大鼠模型制作体会＊

谭州科，张子阳，罗 茜，唐 智，杨亦彬

(遵义医学院附属医院肾内科，贵州 遵义 563099)

长期使用环孢素A(CsA)导致的慢性环孢素肾病(CCN)是引起移植术后移植肾失功的重要原因之一，然而CsA仍是目前最重要的器官移植一线抗排斥药物［1］，因此探讨慢性环孢素肾病的发病机制并寻找有效的阻止或延缓慢性环孢素肾病的方法有重要意义。建立慢性环孢素肾病模型是进行干预实验的基础，本实验拟通过建立慢性环孢素肾病大鼠模型观察其可行性，并总结该模型制作体会，为进一步研究慢性环孢素肾病的发病机制及其防治积累有价值的模型制作资料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 环孢素溶液50 mL:5g(由杭州中美华东制药有限公司提供)，溶解于橄榄油，兔抗大鼠TGF－β，兔抗大鼠α－SMA一抗(美国Santa Cruz)，羊抗兔IgG(北京中杉生物技术公司)。

1.2 实验分组及方法 雄性SD(Spragye－Dawley)大鼠，体重200～220 g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，清洁级(合格证号SCXK(渝)20070003)。低盐饮食参考照 Rosen 等［2］介绍的配方委托第三军医大学实验动物中心配制，测定钠含量为0.046%(原子吸收火焰法测定)。低盐饮食饲养7 d后，随机分为4组:环孢素模型组(n=12):参照文献［3］将环孢素用橄榄油稀释成8 g/L，按 25 mg·kg－1·d－1，灌胃，每天 1 次。溶剂对照组(n=12):予橄榄油 2.5 mL·kg－1·d－1。低盐对照组(n=12):低盐饮食。正常对照组(n=6):正常饮食。前三组均自由摄取低盐饮食，饮用自来水，7d称一次体重，调整环孢素给药量。分别于第4、6周实验终点前置大鼠于代谢笼，收集24 h尿液检测尿蛋白;静脉采血用于血肌酐、药物浓度测定;肾组织置于10%甲醛浸泡，用于组织学和免疫组织化学检查。实验过程中观察各组大鼠体重、饮食、尿量、皮毛、活动度等。于2、4、6周监测环孢素血药物浓度(给药24 h后取静脉血，采用荧光偏振免疫法)。

1.3 肾组织病理学检查 将固定好的肾脏组织石蜡包埋并切片，厚度为3～4 μm。肾脏组织切片行HE、Masson染色。HE染色切片在高倍镜(×400)下，每例随机选择20个不重复视野，主要观察肾小管上皮细胞肿胀、脱落、空泡变性，以及小管萎缩等肾小管损伤;炎症细胞浸润;小动脉病变情况，具体评分标准参考Shihab［4］报道的方法进行半定量评分。Masson染色观察间质纤维化程度:在100×镜下尽量避开肾小球和血管采集图像，每例采集10个不重复视野，用HPIAS21000病理图文分析系统根据病变的百分数判定积分，将呈现为绿色的区域作为阳性目标，以阳性面积与统计总面积的比值作为间质纤维化的评分标准。评分标准参考国内实验［5］:0为无病变;0.5为 ＜ 5%(每视野);1为5% ～15%;1.5为16% ～25%;2为26% ～35%;2.5为36% ～45%;3为＞45%。

1.4 肾组织TGF－β1、α－SMA免疫组化 按免疫组化SP法进行:脱蜡、水化，3%H2O2中室温放置.蒸馏水洗×3次.EDTA微波修复，冷却至室温，PBS冲洗后加入一抗(兔抗大鼠 TGF－β1/α－SMA)，4℃冰箱过夜，加入二抗(羊抗兔 IgG)，37℃孵育，PBS清洗，DAB反应显色，镜下观察并及时中止反应，苏木素复染。实验中均采用PBS代替一抗作阴性对照，阳性着染可呈棕黄色。IPWin32采图系统对免疫组化染色各组切片进行图片采集，每张切片随机采肾脏皮质部五个视野;以积分光密度(IOD)为指标对染色进行定量分析。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况 各对照组大鼠饮食、活动、体重以及精神状态良好，无大鼠死亡。而环孢素模型组大鼠饮食饮水量减少，精神萎靡，活动差，和毛发变黄、松乱，皮肤可见感染、破溃、脓肿等。与对照组相比，其模型组大鼠体重明显下降(P＜0.05)。实验前4周模型组大鼠死亡1只(4周总死亡率约8%)，4～6周时大鼠死亡3只(6周总死亡率约30%)。死亡原因主要是感染、腹腔脓肿等。空白和载体对照组间各时点无明显差异(P＞0.05，见表1)。

表1 各组大鼠体重变化情况(mg，n=6)

2.2 血肌酐、尿蛋白测定 模型组大鼠4、6周时血肌酐、尿蛋白均高于同时点空白和载体对照组(P＜0.01，见表2)，空白和载体对照组间各时点无明显差异(P＞0.05)。环孢素模型组4周与6周血肌酐、尿蛋白比较无明显统计学差异(P＞0.05)。

表2 各组大鼠血肌酐、尿蛋白情况(n=6)

2.3 环孢素血药物浓度 实验过程监测环孢素药物浓度，第2、4、6周模型组大鼠均保持较高的环孢素血药物浓度，分别为1584 ±126 ng/mL，1781.5 ±113 ng/mL和1435±160 ng/mL。

2.4 肾脏常规病理学检查 空白和溶剂对照组肾小球、肾小管和间质未见明显病理学改变;环孢素模型组4、6周均可见明显的小管和间质改变，主要表现肾小管空泡变性、上皮细胞脱落、小管萎缩，间质炎症细胞浸润，伴有小动脉肌性增厚和玻璃样变，间质增宽，条带状间质纤维化(6周时尤其显著，见表 4、图2)。

表3 各组大鼠肾小管损害和间质纤维化积分(n=6)

图1 各组大鼠肾组织病理学检查(Masson×100)

2.5 大鼠肾脏组织TGF－β1、α－SMA免疫组化检测 各对照组肾组织可见少许TGF－β1表达;4、6周环孢素模型组肾组织TGF－β1表达均增强(P ＜0.01)，在6周时尤为明显，表达部位主要见于肾小球、肾小管和肾间质。在空白对照组和载体对照组α－SMA主要表达于血管区，在肾小管、肾间质很少，而在4、6周环孢素模型组肾小管、间质阳性表达均高于同时间点对照组(P＜0.01见表4，图2)。

表4 各组大鼠肾组织TGF－β1、α－SMA表达水平(IOD值，±s，n=6)

表4 各组大鼠肾组织TGF－β1、α－SMA表达水平(IOD值，±s，n=6)

注.:①组间比较:与各对照组同时点比较，#P＜0.01;②组内比较:▲P＜0.01。

组 别 TGF－β1 4周 6周α－SMA 4周 6周3.93 ±0.09 4.00 ±0.09 3.87 ±0.06 3.93 ±0.04低盐对照组 3.81 ±0.11 4.15 ±0.13 3.36 ±0.10 3.78 ±0.06溶剂对照组 3.90 ±0.09 3.98 ±0.06 3.81 ±0.05 3.95 ±0.03环孢素模型组 5.39±0.11# 5.94±0.10#▲ 5.87±0.06# 6.12±0.04#▲正常对照组

图2 各组α－SMA免疫组化图

3 讨论

慢性环孢素肾病(CCN)是引起慢性移植肾肾病(CAN)的一个重要原因，也是影响移植术后移植物长期存活的一个重要因素［6］。临床慢性CsA肾毒性肾脏病理变化主要表现为:①肾小管萎缩，部分近曲小管上皮细胞空泡变性和坏死;②间质纤维化，常呈现出“正常区域”伴有带状间质纤维组织增生和肾小管萎缩;③可出现全肾小球硬化、节段性灶状肾小球硬化等;④入球小动脉玻璃样变及闭塞性动脉内膜炎［1］。

慢性环孢素肾病模型建立是实施研究的基础。目前制作慢性环孢素肾病动物模型的方法主要有两种［3，5，7］，低盐饮食下或在正常饮食下配合肾上腺切除造成“钠耗竭”，同时间断通过皮下注射或灌胃给予环孢素两种途径造模。由于大鼠对环孢素毒性敏感性差，以至于常规饮食下给予环孢素可能需要半年甚至1年以上时间才能出现环孢素所致的慢性肾间质纤维化，在实验过程中采用低盐饮食或肾上腺切除，其目的主要是造成“钠耗竭”以缩短环孢素致肾间质纤维化的时间［5，7］。手术切除肾上腺，其死亡率较高，而灌胃给予环孢素简单易行，符合临床常规通过口服给予环孢素特点，但低盐饮食是灌胃给药复制慢性环孢素肾病模型成功的关键［3］。我们的实验采用低盐(钠含量0.046%)饮食1周后灌胃给予环孢素，结果4、6周模型组大鼠均出现血肌酐、尿蛋白水平明显升高，肾脏病理显示部分肾小管损伤、空泡变性，小管萎缩，并伴炎症细胞浸润，小动脉玻璃样变，肾间质纤维化，其积分明显高于对照组，且出现体重下降、精神萎靡，活动差，饮食饮水量下降和毛发变黄、松乱，部分鼠皮肤可见感染、破溃、脓肿等。

CCN突出病理改变是小管间质纤维化，本实验选用目前公认的纤维化指标转化生长因子β1(TGF－β1)和α－平滑肌肌动蛋白(α－SMA)以进一步验证，结果显示模型鼠肾脏TGF－β1、α－SMA明显高于对照组，说明本实验构模是成功的，4周成功率为92%，6周成功率约为70%。

对于慢性环孢素肾病大鼠模型制作有以下几点体会:①关于给药时间的选择:本实验分别于4周、6周采样，其4周时结果已显示明显的肾小管损伤、间质纤维化以及肾功能损害和蛋白尿等，而6周时结果尤其突出，且实验大鼠死亡增多、感染率增高，故建议环孢素4周制作慢性环孢素模型更合适。②由于CsA为脂溶性药物，为便于实验给药常采用橄榄油作为溶解介质，本实验设立橄榄油对照组，结果未发现与空白对照组间存在着观察指标的差异，说明用橄榄油作为CsA稀释剂是可行的，但本实验也发现给予作为稀释剂的橄榄油量过多(在预实验中发现给予环孢素橄榄油溶液1.5mL/d)时易导致实验大鼠腹泻，既可能影响成模率，也可能影响环孢素吸收，故稀释剂橄榄油量不超过1.5mL为宜。③本实验分别于2、4、6周观察大鼠血环孢素浓度，结果显示模型组大鼠环孢素血药物明显偏高，约为人体器官移植后环孢素血药物浓度的4～5倍，认为与大鼠较人对环孢素毒性敏感性差相关，故需维持较高血药物浓度才能引起慢性肾损伤作用。且预实验发现组内环孢素血药物相差较大，且环孢素血药物浓度可能受到某些中药制剂影响，如某些黄酮类药物可能致其药物浓度改变［8］，建议在利用药物防治CCN动物实验中可加测环孢素血药物浓度。

［1］Maarten Naesens，Derk R J，Minnie Sarwal.Calcineurin Inhibitor Nephrotoxicity［J］.Clin J Am Soc Nephrol，2009，4:481-508.

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［3］乔保平，张亚伟，李道明，等.大鼠口服环孢素A的慢性肾毒性模型的建立［J］.中华器官移植杂志，2000，21(3)∶158-160.

［4］Shihab F S，Bennett W M，Tanner A M.Angiotensin II blockade decreases TGF－β1 and matrix proteins in cyclosporine nephropathy［J］.Kidney Int，1997，52:660 －673.

［5］王沛，刘章锁，骆红，等.长期应用环孢素A致大鼠肾脏病变演变过程观察［J］.郑州大学学报:医学版，2007，42(6):1044－1048.

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［7］孙巧玲，谌贻璞，芮宏亮.一种新型环孢素A慢性肾毒性大鼠模型的建立［J］.中国医学科学院学报，2010，32(2):205－209.

［8］Jun Shik Choi，Byung Chul Choi.Effect of quercetin on the pharmacokinetics of oral cyclosporine Am J Health－Syst Pharm，2004，61:2406 －2409.