AQP 9在羊水过少人羊膜上皮细胞的表达及地塞米松的干预效应＊

李萍萍，胡 琼

(遵义医学院附属医院，贵州 遵义 563099)

羊水过少使围生儿发生率及死亡率明显增 高，严重影响胎儿预后。胎膜与羊水的吸收及母体与羊水的物质交换有密切的关系，羊膜作为其构成的胎膜部分，在维持羊水的平衡中具有重要的作用。水通道蛋白(Aquaporin，AQP)，又叫水孔蛋白，是一组细胞膜转运蛋白，可显著增加细胞膜水通透性，在维持机体水平衡中起重要作用，与羊水的形成过程密切相关。其中，AQP9可在人胎盘和胎膜表达，提示AQP9可能对于维持羊水量稳态平衡具有重要作用［1］。近年来研究发现糖皮质激素对可影响水通道蛋白在水平衡中的作用，而糖皮质激素在产科已广泛应用，但对羊膜水通道蛋白的影响报道较少。羊水过少病因至今仍未明确，无法进行针对性治疗，水通道蛋白的提出和胎膜中AQP9的检出，可能使糖皮质激素影响羊水形成机制的研究有新突破。因此，探讨羊水正常与羊水过少产妇羊膜上皮细胞(hAECs)AQP9mRNA的表达及地塞米松对其表达的影响，可为临床预防和治疗羊水异常引起的高危妊娠提供新思路。

1 材料与方法

1.1 样本纳入标准 选取2011年7月至2012年7月在遵义医学院附属医院行足月妊娠剖宫产分娩的羊水正常及羊水过少产妇各15例为研究对象，均为单胎，无药物服用史，无其他妊娠合并症及并发症。依据羊水指数(AFI)和术中统计羊水量的标准分类［2］。具体标准如下:羊水正常样本纳入标准为产前最后一次B超检查AFI为8～20 cm，术中羊水量为300～2 000 mL;羊水过少样本纳入标准为产前最后一次B超检查AFI≤5 cm，术中羊水量＜300 mL。

1.2 样本采集 分别无菌剥离羊水正常和羊水过少产妇胎盘娩出后的羊膜组织。

1.3 hAECs的原代、传代培养及纯化 剪碎羊膜，加入0.05%胰蛋白酶 －0.02%EDTA －2Na，于37°C水浴箱中消化30 min，用等体积含10%胎牛血清(FBS)的培养基终止消化，用300目不锈钢筛网过滤并收集单细胞悬液，重复三次［3］。1 500 rpm离心10 min，用 LG－DMEM 培养基(含10%FBS、1% 非必需氨基酸、2 mmol/L L－谷氨酰胺、10 ng/mL EGF)重悬细胞，2%台盼蓝染色检测细胞活力后，以5×105个/mL密度接种于培养瓶中，在5%CO2，37℃，饱和湿度条件下培养，3d后换液，以后隔日换液。待细胞生长融合至80% ～90%时，用0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA－2Na消化并收集细胞，按1∶2～3传代培养，同时用差异黏附法［4］纯化细胞，以5×105个/mL浓度再接种培养，每2天换液1次，倒置显微镜下观察生长情况。

1.4 培养细胞的鉴定 制备第3代hAECs细胞爬片，用PBS漂洗后经4%多聚甲醛固定、0.3%Triton－X100破膜、正常羊血清封闭等过程后滴加鼠抗人CK19或鼠抗人波形蛋白单克隆抗体37°C孵育30 min，充分漂洗后，滴加鼠兔通用型二抗37°C孵育30 min，用二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，中性树脂封片。阴性对照组加PBS替代一抗。

1.5 流式细胞仪检测 收集新鲜分离的第三代hAECs，调整细胞密度1×106/mL，取细胞悬液200 μl，分别加入 10 μl荧光标记单抗:CD29 － PE、CD44－FITC、CD45－FITC、CD166－PE混匀，室温避光孵育25 min，每管加2 mL含0.1%NaN3的PBS溶液，混匀，1 000 r/min离心5 min，弃上清，振荡重悬细胞，每管加入200 μl含1%多聚甲醛的PBS溶液，混匀，4℃避光放置，24 h内用流式细胞仪(BD公司)分析，每份样品的采集细胞数≥20 000个，用Cell Quest软件进行分析。同型对照为相应荧光素标记的小鼠IgG。

1.6 培养细胞分组 分别取羊水正常和羊水过少的第3代融合至80% ～90%生长良好的hAECs。根据地塞米松不同浓度分为5组:0 μg/mL组(对照组)、10 μg/mL 组、20 μg/mL 组、40 μg/mL 组、100 μg/mL 组［5］，进行无血清培养基培养，48 h 后，用于后续实验。

1.7 hAECs AQP9 mRNA的检测 经地塞米松干预48 h后的hAECs用RNAiso Plus(大连宝生物)按试剂盒分别提取总RNA，严格按说明书进行操作。紫外分光光度计分别测总RNA样品的浓度和OD260/OD280值。按逆转录试剂盒(大连宝生物)操作说明进行逆转录成cDNA后，再进行real－time RT－PCR扩增。AQP9引物(大连宝生物合成)序列:上游序列 5’TGCAACCGTCTTTGGCATTTA3’，下游序列5’CAAATGCGTTCGCCAGAGATA3’，扩增片段长度137 bp;GAPDH引物序列:上游序列5’GCACCGTCAAGGCTGAGAAC3’，下游序列 5’TGGTGAAGACGCCAGTGGA3’，扩增片段长度138 bp。反应体系 20 μl，反应条件为:95℃ 3 min，95℃10s，61.4℃ 30 s，55℃ 10 s。计算 AQP9 mRNA 的相对表达量［6］。

1.8 统计学处理 所得实验数据均采用 SPSS 17.0统计软件进行统计分析，结果以均值±标准差(±s)表示。两组间比较采用独立样本t检验，不同浓度之间差异比较满足正态性及方差齐性检验后采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hAECs的分离、培养及纯化结果 培养24 h后，有少量细胞贴壁呈圆形;第3天后贴壁的细胞数量迅速增多，形态多为三角形和卵圆形，其间混杂少量梭形细胞(见图1 A)。经差异黏附法纯化，传代6 h后即开始贴壁生长，24 h后细胞生长较快，培养3～4 d后细胞排列紧密，呈铺路石样外观(见图1B)。可见细胞核清晰，位于胞质中央，细胞质均匀，核质比大，透光度好。传至6代后，细胞增殖速度明显减缓，胞体体积变大。地塞米松干预前和干预后各实验组细胞形态无差异。

图1 hAECs培养形态(×200)

2.2 免疫细胞化学染色鉴定结果 免疫细胞化学染色检测结果显示，第3代培养细胞表达上皮标志的角蛋白CK19(见图2A)，不表达波形蛋白(见图2C)。

2.3 流式细胞仪分析结果 新鲜分离的第三代 hAECs高表达 CD29(99.61%)、CD166(97.11%)，低表达 CD44(14.67%)，不表达 CD45(见图3)。

2.4 real－time RT－PCR 检测 AQP9 mRNA 的表达 经OD260nm/280nm值检测样本总RNA符合实验要求。进行逆转录及real－time RT－PCR扩增后计算AQP9mRNA的相对表达量，其值见表1、2。结果显示:羊水过少较羊水正常样本AQP9mRNA表达量减低，其差异有统计学意义(P＜0.05);经不同浓度地塞米松干预后各组，与对照组比较，AQP9mRNA表达均增加，其差异有统计学意义(P＜0.05);羊水正常样本中地塞米松40μg/mL组的AQP9mRNA的表达量最高，羊水过少样本中地塞米松20 μg/mL组AQP9 mRNA的表达量最高。

表1 羊水正常与羊水过少样本的AQP9mRNA的相对表达量(n=15，±s)

表1 羊水正常与羊水过少样本的AQP9mRNA的相对表达量(n=15，±s)

注:每组实验重复3次，羊水过少样本与羊水正常样本比较，P ＜0.05。

检测指标 羊水正常样本 羊水过少样本AQP9mRNA 141.16 ±23.72 72.64 ±11.72

表2 地塞米松干预后各样本的AQP9mRNA的相对表达量(n=15，±s)

表2 地塞米松干预后各样本的AQP9mRNA的相对表达量(n=15，±s)

注:每组实验重复3次，*与0μg/mL组比较，P＜0.05。

样 本 0 μg/mL组 10 μg/mL组 20 μg/mL组 40 μg/mL组 100 μg/mL组羊水正常 42.31 ±11.80 89.22 ±18.85* 117.56 ±15.70* 184.57 ±29.82* 124.78 ±20.66*羊水过少 51.91 ±5.54 129.06 ±26.94* 188.05 ±41.61* 118.37 ±24.52* 97.21 ±25.91*

3 讨论

水通道蛋白(AQPs)因其可增加质膜脂质双分子层的水通透性而得名，均为一类小分子膜蛋白。目前在哺乳动物中共发现13种水通道蛋白，即AQP0～AQP12［7］。近年研究发现胎膜上存在多种功能性的水通道蛋白，Beall MH［8］等通过对孕期鼠羊水量及羊水构成的研究，发现羊水量可能与AQPs有关，AQPs可能通过调节胎盘膜内水流最终改变羊水量，推测羊水膜内吸收主要决定于AQPs［9］。胎盘是母胎液体交换的主要部位，但是，胎盘在液体平衡中的分子机制还未完全阐明。有人用数字模型对人的羊水动力学进行研究发现胎膜内存在显著的水及电解质的流动［10］。由于胎儿血液循环中渗透压(280mOsm/kg)，远远大于羊水渗透压(255mOsm/kg)，故羊水膜内转运途径是在渗透压的作用下顺渗透压梯度从羊膜腔内流至胎儿血循环，显然，羊膜在其中发挥着重要作用。有人在长期插套管的胎绵羊体内，观察膜吸收在羊水容量调控中的作用［11］，结果发现水分子跨膜转运的能力较强，不受流动速率的限制，羊水内成分可调节短期膜内流速，实际上最终还是渗透压起决定性作用。因此，羊水膜内吸收机制可能是通过改变渗透压来调节跨膜水流动，从而改变羊水量。

Wang［1］等通过原位杂交显示AQP9在羊膜上皮细胞、绒毛膜细胞滋养层及胎盘合体滋养细胞和细胞滋养细胞均有表达。目前，还发现胎膜中表达AQPl、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8 等，这些 AQP 是否参与了羊水膜内平衡的调节呢?国内外学者对其进行了探讨:Zhu X［12］等发现特发性羊水过多产妇羊膜中的AQP8及羊膜和绒毛膜中的AQP9的表达均有很大程度的提高;郝荣增［13］等通过RTPCR研究发现，AQP1mRNA在羊水过少临床病例胎膜组织表达显著低于正常晚期妊娠胎膜组织;Shioji M［14］等用前列腺素F2α受体(FP)复制羊水过少鼠模型，通过免疫组化及蛋白印迹发现受孕20 d鼠AQP8蛋白较受孕14 d表达下降60%，表明过期妊娠导致羊水量减少可能与AQP8的减少有关;我们通过比较羊水过少与羊水正常的表达差异发现羊水过少产妇hAECs AQP9mRNA表达量降低。因此，上述研究提示:AQP9在母胎液体交换中可能发挥重要作用，而且AQP9 mRNA在羊膜组织中的表达减少可能是羊水过少的病理分子机制之一，这在水代谢障碍疾病的病理认识和治疗中具有重大意义。

糖皮质激素有抗炎、免疫抑制和抗休克等广泛的药理活性［15］。产科主要用于产前促胎肺成熟。然而，目前地塞米松对羊膜上皮细胞AQP9表达的影响报道甚少。本实验应用地塞米松干预，通过real－time RT－PCR观察AQP9mRNA在羊水正常和羊水过少的hAECs的表达情况。结果显示:不同浓度地塞米松干预前后各组的hAECs形态均无明显差异，但其AQP9mRNA的表达量羊水过少样本明显低于羊水正常样本，说明地塞米松能够上调hAECs AQP9mRNA的表达，增强hAECs对羊水的转运，且在一定范围内，存在剂量依赖关系。因此，我们推测地塞米松可通过影响AQP9的表达来影响其他小分子溶质的跨膜转运，从而来改变羊水渗透压导致羊水量的改变，但其具体机制尚需进一步研究。

综上所述，AQP9在羊膜上皮细胞中的表达有重要作用。进一步研究AQP9的调节机制，对有羊水过少孕妇早期进行特异性干预，从而减少羊水过少并发症的发生，降低围产儿的病死率，达到优生、优育。

［1］Wang S，Chen J，Beall M，et al.Expression of aquaporin 9 in human chorioamniotic membranes and placenta［J］.Am J Obstet Gynecol，2004，191(6):2160 －2067.

［2］乐杰，谢幸，林仲秋，等.妇产科学［M］.第7版.北京:人民卫生出版社，2011.126 －129.

［3］方宁，张路，宋秀军，等.人羊膜上皮细胞的分离、培养及鉴定［J］.遵义医学院学报，2009，32(2):121 －123.

［4］金玲，陈剑，吴静，等.人羊膜上皮细胞的分离、纯化及其生物学特性研究［J］.广东医学，2010，31(16):2055－2057.

［5］李燕、漆洪波.地塞米松对人羊膜上皮细胞Wish细胞株水通道蛋白8表达的影响［J］.中华妇幼临床医学杂志，2008，4(5):5 －7.

［6］刘森，王艳林，刘朝奇，等.PCR聚合酶链反应［M］.北京:化学工业出版社，2009.94 －98.

［7］Zardoya R，Villalba S.A phylogenetic framework for the aquaporin family in eukaryotes［J］.J Mol Evol，2001，52(5):391－404.

［8］Beall M H，Wang S，Yang B et a1.Placental and membrane aquaporin water channels:correlation with amniotic fluid volume and composition ［J］.Placenta，2007，28(5－6):421－428.

［9］Feng X C，Ma T H.Water channel activity of plasma membrane affects chondrocyte migration and adhesion［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2008，35(1):7 －10.

［10］Papadopoulos M C，Saadoun S，Verkman A S.Aquaporins and cell migration［J］.Pflugers Arch，2008，456(4):693－700.

［11］Daneshmand S S，Cheung C Y，Brace R A.Regulation of amniotic fluid volume by intramembranous absorption in sheep:role of passive permeability and vascular endothelial growth factor［J］.Am J Obstet Gynecol，2003，188(3):786－793.

［12］Zhu X，Jiang S，Hu Y，Zheng X，et al.The expression of aquaporin 8 and aquaporin 9 in fetal membranes and placenta in term pregnancies complicated by idiopathic polyhydramnios［J］.Early Hum，2010，86(10):657 －720.

［13］郝荣增，刘慧姝，熊正方，等.水通道蛋白－1在人羊水过少胎盘和胎膜组织中的表达［J］.南方医科大学学报，2009，2(6):1130 －1132.

［14］Shioji M，kuda H，anzaki T，et al.Reduction of aquaporin－8 on fetal membranes under oligohydramnios in mice lacking prostaglandin F2 alpha receptor［J］.J Obstet Gynaecol Res，2006，32(4):373 －378.

［15］杨宝峰，苏定冯.药理学［M］.第6版.北京:人民卫生出版社，2007.361 －365.