肝纤维化相关细胞因子双重RNA干扰质粒的构建及转染肝星状细胞研究*

蒋玉凤 周德江 张建军 黄 飞 史小玲

转化生长因子β（transforming growth factorβ,TGF-β）及其信号转导途径在肝纤维化发生机制中起着关键作用[1，2]。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF） 与金属蛋白酶组织抑制因 子 1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1）都是TGF-β信号传导途径的下游信号介质[3，4]， 针对CTGF和 TIMP-1的小RNA干扰阻断TGF-β下游信号途径，将有望成为一种更特异和更有效的长期防治肝纤维化的手段。本研究旨在设计并构建同时含CTGF和TIMP-1靶基因片段的双重RNA干扰重组质粒，并转染到大鼠肝星状细胞，为进一步研究其对肝星状细胞细胞因子和细胞外基质分泌做准备。

材料与方法

一、材料 真核表达载体psiRNA-DUO-GFPzeo、感受态大肠杆菌Lyo Comp GT115、Fast-Medi aRZeoX-Gal、Fast-MediaRZeoX-GUS、lipofectamine（ 脂质体）2000试剂、Zeocin抗生素购自InvivoGen公司；限制性内切酶ACC 65I、Hind III、 BbsI、MakerO'RangeR μlerTM1000bpDNALadder、MakerO'RangeRμlerTM50bp DNA Ladder与T4 DNA连接酶购自Fermentas公司；少量质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；胎牛血清购自天津TBD公司；目标OligoDNA由上海生工合成；大鼠肝HSC-T细胞株由我院中心实验室冻存。

二、CTGF和TIMP-1短发卡RNA（short hairpin RNA,shRNA）序列的设计与合成 在线查询大鼠CTGF和TIMP-1基因序列，设计3个RNA干扰靶位，化学合成双链RNA（dsRNA），各自转染或不同组合转染经TGF-β1刺激活化的大鼠肝星状细胞。筛选出对Ⅲ型胶原、透明质酸、粘连蛋白抑制作用最强的RNA干扰候选靶位[5]（前期研究中已完成），即 CTGF：5’-GCCAGGAGAAAGACAGGUACU 和TIMP-1：5’-GCCUUCGUAAAGACCUAUAGU。 为便于克隆和鉴定，shRNA干扰序列的5'端和3'端分别引入ACC 65I和Hind III酶切位点，反义片段后接终止信号TTTTT以终止转录。形成ACC 65I+正义链+Loop+反义链+终止信号+Hind III的靶序列结构模式。在真核表达质粒psiRNA-DUO-GFPzeo（6046bp）中插入CTGFshRNA序列，再用BbsI双酶切（质粒中含两个BbsI酶切位点），再插入TIMP-1shRNA序列，形成BbsI+正义链+Loop+反义链+终止信号+BbsI的靶序列结构模式。针对CTGF和TIMP-1基因的shRNA片段序列见表1。

表1 针对大鼠CTGF和TIMP-1基因的shRNA靶序列

三、重组质粒 psiRNA-GFP-CTGF和 psiRNA-GFP-TIMP-1的构建及鉴定用内切酶ACC 65I和Hind III双酶切空载质粒psiRNA-DUO-GFPzeo，胶回收目的线性DNA；用灭菌三蒸水将shRNA片段溶解，终浓度为25μM。按以下条件完成退火：正义链2μl， 反义链 2μl，NaCl 6μl， 加三蒸水到总体积30μl，80℃ 水 浴 2min。将线性载体质粒psiRNA-DUO-GFPzeo与退火shRNA片段用T4 DNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌，接种到含博莱霉素（ zeocin）的 Fast-MediaRZeoX-Gal固体培养基，做蓝白筛选后提取重组质粒psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1，分别用ACC 65I和Hind III双酶切，通过电泳图初步鉴定重组质粒是否构建成功，并各取20μl重组质粒送上海生物工程公司测序。

四、重组质粒psiRNA-GFP-Com（含有C TGF和TIMP-1）的构建及鉴定 将测序确定构建成功的重组质粒psiRNA-GFP-CTGF用内切酶BbsI双酶切（内切质粒中两个不同位置的BbsI位点)，胶回收目的线性质粒，psiRNA-GFP-CTGF与退火shRNA片段连接，转化感受态大肠杆菌，并接种至Fast-MediaRZeo GUS固体培养基，将蓝白筛选后提取的重组质粒psiRNA-GFP-Com与空载质粒psiRNA-DUO-GFPzeo分别用内切酶BbsI双酶切（内切质粒中两个不同位置的BbsI位点），酶切产物电泳显示重组质粒构建成功后，取20μl重组质粒送上海生工测序鉴定。

五、重组质粒转染肝星状细胞 取肝星状细胞培养，应用Lipofectamine 2000将质粒转染细胞，每组两孔。分组如下：CTGF组（转染质粒psiRNA-GFP-CTGF）、TIMP-1组（转染质粒psiRNA-GFP-TIMP-1）、CTGF+TIMP-1组（ 转染质粒psiRNA-GFP-CTGF和 psiRNA-GFP-TIMP-1)、Com组【转染质粒psiRNA-GFP-Com（含有C TGF和TIMP-1）】、空质粒组（转染空载质粒psiRNA-DUO-GFPzeo）与空白对照组（以等量无血清培养基代替质粒与脂质体混合）。在转染24小时和48小时后，在显微镜下观察绿色荧光，并使用流式细胞仪检测每组细胞中荧光蛋白（GFP）表达情况，并以GFP表达的比率来确定转染效率。

结果

一、重组质粒psiRNA-GFP-CTGF和psiRNA-GFP-TIMP-1酶切电泳鉴定 重组质粒psiRNA-GFP-CTGF和 psiRNA-GFP-TIMP-1用ACC 65I和Hind III双酶切，其产物经电泳符合预期，重组质粒psiRNA-GFP-CTGF和psiRNA-GFP-TIMP-1双酶切产物均有一大小约5711bp（6046-335+23-23）片段（ 图1）。

二、重组质粒 psiRNA-GFP-CTGF和psiRNA-GFP-TIMP-1测序鉴定 经测序显示重组质粒psiRNA-GFP-CTGF和psiRNA-GFP-TIMP-1中siRNA编码序列与设计片段完全一致，表明载体构建成功（ 图 2、图 3）。

三、psiRNA-GFP-Com酶切电泳鉴定 psiRNA-GFP-Com经BbsI双酶切（内切质粒中两个不同位置的BbsI位点)产物电泳符合预期，电泳图谱中显示重组质粒psiRNA-GFP-Com双酶切产物中有一大小约 3782bp（5711-1929+23-23）片段（ 图 4）。

四、重组质粒psiRNA-GFP-Com测序分析 经测序结果显示重组质粒psiRNA-GFPCom（同时含有C TGF和TIMP-1，将psiRNA-GFP-CTGF重组质粒用BbsI双酶切后连接上TIMP片段）中siRNA编码序列与设计片段完全一致，表明重组质粒psiRNA-GFP-Com构建成功（图5）。

五、转染效率测定情况 经流式细胞仪测定，空白对照组无GFP表达，空质粒和各组重组质粒均有荧光蛋白表达，初步证实各重组质粒均能转染肝星状细胞。同时，在24小时和48小时，空质粒组、CTGF组、TIMP-1组与CTGF+TIMP-1组转染效率无统计学差异（P＞0.05），而它们的转染效率均低于质粒psiRNA-GFP-Com转染组（Com组），差异有统计学意义（P＜0.05），说明Com组转染效率最高（表2）。

表2 各组质粒的转染效率（%，）

表2 各组质粒的转染效率（%，）

与Com组比，①P＜0.05

24h 48h空白对照 无 无空质粒 15±2① 10±2①CTGF 13±1① 9±1①TIMP-1 15±1① 8±2①CTGF+TIMP-1 14±2① 10±1①Com 20±2 15±2

讨论

RNA干扰是作用于mRNA水平的基因沉默技术，细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成21～23bp大小的小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA)，精确降解与 siRNA序列相同的mRNA，能特异性抑制靶基因的转录，进而抑制该基因在细胞内的翻译，达到转录后水平的基因静默[6，7]。由于siRNA表达载体成功转染后可进行瞬时或稳定的基因沉默，因此相对于化学合成的siRNA更有应用价值和前景[8]。

CTGF是新近发现的一种促器官纤维化的重要细胞因子。在TGF-β的诱导下，由成纤维细胞等间质细胞产生，反过来又介导TGF-β对间质的作用，被认为是TGF-β的下游部分生物学功能介质，CTGF在TGF-β诱导下的异常高表达在肝纤维化的发生、发展过程中始终起着关键作用[9，10]。

基质金属蛋白酶（Matrix mealloproteiuases，MMP）在ECM降解过程中起主要作用，而其活性可特异性地被TIMP所抑制，其中TIMP-1对MMP的活性抑制作用最强[11]。TGF-β及其信号转导途径可诱导TIMP-1产生，从而阻断MMPs对ECM的降解[12]。因此，TIMP-1也是TGF-β1生物学作用的下游效应介质。

从理论上讲，通过靶向抑制CTGF和TIMP-1表达可抑制纤维化的发生和发展。本研究筛选出对CTGF和TIMP-1具有干扰作用的RNA序列，构建了双重RNA干扰重组质粒psiRNA-GFP-Com（同时含有C TGF和TIMP-1siRNA编码序列），并成功转染肝星状细胞。下一步研究拟采用针对CTGF和TIMP-1的RNA双重干扰，力求从阻断CTGF对ECM形成和解除TIMP-1对ECM的降解抑制（促进降解）两方面着手，研究双重RNA干扰重组质粒psiRNA-GFP-Com对肝星状细胞细胞因子表达及ECM分泌的影响。

本次实验质粒转染效率不是太高,而质粒转染效率与碱基数目有一定的关系[13]。

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