不同临床类型HBV感染者外周血T淋巴细胞亚群的变化*

张健珍 曾春燕 张春兰 张烈光 赵令斋 姚细安 袁小珍

人体感染HBV后，病毒与人体的免疫细胞之间相互作用，共同影响着乙型肝炎的病程和转归，其中宿主免疫状态是决定乙型肝炎临床转归和治疗疗效的主要因素，外周血T淋巴细胞亚群是反映乙型肝炎患者免疫状态的重要指标[1]。T淋巴细胞亚群功能紊乱是导致人体不能清除HBV、使病情慢性化及造成肝细胞损伤的主要原因[2]。国内外对T淋巴细胞免疫在乙型肝炎发病中的作用报道较多，但结果不尽一致[3～5]。我们对不同HBV感染者外周血淋巴细胞亚群进行了检测，以期了解慢性HBV感染的不同疾病阶段T淋巴细胞亚群的变化规律及其临床意义，现报道如下。

资料与方法

一、病例选择 2008年1月～2011年12月我院住院的患者 230例，男 176例，女 54例，年龄10～78岁，平均年龄42.0±14.4岁。慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化的诊断符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》的标准[6]。慢性肝衰竭的诊断符合2006年《肝衰竭诊疗指南》的标准[7]，其中慢性乙型肝炎轻度33例、中度50例、重度32例，乙型肝炎肝硬化64例，慢性乙型肝炎肝衰竭51例。甲、丙、丁、戊型肝炎病毒和HIV标记物为阴性，排除肝癌、自身免疫性疾病、感染等引起T细胞亚群异常的疾病。另选同期本院健康体检的医护人员30例作为正常对照组，男16例，女 14例，年龄 20～60岁，平均年龄 39.4±11.6岁，均无乙型肝炎及其他引起T细胞亚群变化的疾病

二、临床检测 采用电化学发光法检测乙型肝炎病毒血清标记物（罗氏Cobase601全自动免疫分析仪和罗氏诊断产品上海有限公司）；采用实时荧光定量PCR核酸分析仪（美国ABI7300型）检测血清 HBVDNA，检测下限值为 500IU/ml（中山大学达安基因公司）。

三、外周血T淋巴细胞亚群检测使用的三色标记单克隆抗CD3+、CD4+和 CD8+分别与FITC、PE、PerCP荧光素结合；含beads的TrueCount管；CaliBRITEbeads；10×FACS溶 血素（美国BD公司）。FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）。检测方法：①抽取病人外周血2ml，用肝素钠抗凝，6小时内分析。向TrueCount管分别加入120μl抗体和50μl抗凝全血，振荡混匀3秒，避光放置15分钟；加1×7浓度的溶血素450μl，振荡混匀后避光放置15分钟，然后上机检测；②使用CaliBRITE标准微球、FACSComp软件调节FACSCalibur流式细胞仪PMT电压、荧光补偿、灵敏度，应用MultiSet分析软件对处理好的标本进行CD3+、CD4+和CD8+细胞绝对值计数。

四、统计学分析 采用SPSS18.0软件进行统计分析，先进行方差齐性检验，将HBVDNA水平进行对数转换，各组间计量数据以表示，组内和组间数据的显著性比较采用单因素方差分析和两两比较的q检验，HBVDNA水平与T淋巴细胞亚群之间关系采用双变量Pearson相关分析，P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有非常显著性差异。

结果

一、不同临床类型HBV感染者外周血T淋巴细胞亚群变化的比较 见表1。与正常对照组和慢性乙型肝炎轻中度比，慢性乙型肝炎重度、肝炎肝硬化和慢性乙型肝炎肝衰竭患者CD3+、CD4+和CD8+细胞及 CD4+/CD8+细胞比值显著下降（ P<0.05或 P<0.01）。

表1 不同临床类型慢性HBV感染者外周血T淋巴细胞亚群（）比较

表1 不同临床类型慢性HBV感染者外周血T淋巴细胞亚群（）比较

与正常对照组比，①P<0.05，②P<0.01；与慢性乙型肝炎轻、中度组比，③P<0.05，④P<0.01

例 数CD3+（ 个 /μl）CD4+（ 个 /μl）CD8+（ 个 /μl） CD4+/CD8+正常对照 301388.0±563.9 731.6±251.9 601.9±296.9 1.7±1.0肝硬化 64 982.4±509.5①③ 518.6±346.9①③ 445.6±353.9①③ 1.3±0.4①③慢性肝衰竭 51 945.5±382.5②④ 509.5±277.8②④ 426.1±198.6②③ 1.3±0.5①③慢性肝炎轻度中度重度331352.5±492.0 700.6±313.9 573.9±339.2 1.6±0.9 501303.7±540.3 689.5±293.7 568.1±243.2 1.6±0.4 321002.9±420.3③① 553.4±242.0①③ 462.7±190.9①③ 1.3±0.8①③

二、HBeAg阳性与HBeAg阴性慢性HBV感染者T淋巴细胞亚群的比较 见表2。HBeAg阳性组CD3+、CD4+和CD8+细胞数与正常对照组比，差异无统计学意义（P>0.05），而HBeAg阴性组明显低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。HBeAg阴性组 CD3+、CD4+和 CD8+细胞数均低于 HBeAg阳性组，差异有统计学意义（P<0.05）。

表2 HBeAg阳性与HBeAg阴性慢性HBV感染者T细胞亚群（ ）的比较

表2 HBeAg阳性与HBeAg阴性慢性HBV感染者T细胞亚群（ ）的比较

①P<0.05

例数 CD3+（ 个 /μ）CD4+（ 个 /μl）CD8+（ 个 /μl） CD4+/CD8+HBeAg阳性 981291.1±559.2 689.1±298.5562.1±323.8 1.5±0.5 HBeAg阴性 1321020.1±543.1① 564.4±315.6① 454.6±249.6① 1.7±0.7

三、患者HBVDNA水平与CD3+、CD4+和CD8+细胞数和CD4+/CD8+比值的相关性 本组230例患者 HBVDNA与 CD3+、CD4+和 CD8+细 胞 数 和CD4+/CD8+比值无相关性（ r=0.196，P=0.087；r=O.192，P=0.079；r=0.139，P=0.064；r=-0.111，P=0.093）。

讨论

目前认为宿主免疫调控紊乱是导致慢性肝损伤的主要原因，其中由T淋巴细胞亚群介导的细胞免疫以及细胞因子网络的调控异常起着重要的作用。CD4+细胞即T辅助/诱导细胞（Th细胞），在免疫应答中被抗原激活后诱导细胞免疫和体液免疫，它能促进B细胞、细胞毒性T细胞（CTL）及其他免疫细胞的增殖和分化，具有较强的抗病毒效应[8]。CD8+细胞包括抑制性T细胞（Ts）和杀伤性T细胞（Tc）。CD8+CTL在被细胞因子激活后，产生穿孔素和颗粒酶，将靶细胞破坏，这是HBV感染后引起肝细胞损伤的主要原因，也是机体清除细胞内病毒的主要机制[9]。检测外周血T淋巴细胞亚群是反映机体细胞免疫状态的重要指标之一。当T淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，可导致免疫功能紊乱而发生持续HBV感染。

本组资料结果显示，慢性乙型肝炎重度、肝炎肝硬变、慢性肝衰竭患者外周血CD3+、CD4+和CD8+细胞数和CD4+/CD8+比值均低于正常对照组和慢性肝炎轻中度组，提示慢性乙型肝炎病情严重时，细胞免疫功能减低[10]。CD4+T细胞数量下降，导致机体无法有效清除病毒，使感染变得迁延[11，12]。CD4+/CD8+比值是监测人体细胞免疫功能，反映机体免疫状态的重要指标，此比值失衡可以导致免疫系统紊乱和一系列免疫病理改变[13]。

通过对230例HBV感染者HBV DNA水平与T细胞亚群的相关性分析，发现CD3+、CD4+和CD8+细胞数和CD4+/CD8+比值均与HBV DNA水平无相关性，与钟苟华和吴健林等报道一致[14～16]。

HBV变异引起宿主免疫应答的相应变化，往往使感染后的病情进展趋于复杂。所以感染HBV变异株的乙型肝炎患者，其体内免疫应答往往不能有效抑制病毒的复制，导致病情加重，病程迁延。本组资料显示，HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者CD3+、CD4+和CD8+细胞数均低于HBeAg阳性患者，而两组CD4+/CD8+比值无明显差别，与周宝勤等报道相似[17，18]。HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者体内HBV前C区发生1896nt G→A变异后，使得末端产生终止密码，导致前C蛋白合成中断，造成HBeAg消失，特异性的CD4+T细胞缺乏适当的抗原刺激或不能识别变异的表位，导致病毒得以逃避机体的免疫攻击，不利于宿主免疫系统对病毒的清除。

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