ABCB4基因外显子6突变与妊娠期肝内胆汁淤积症的相关研究

李玉红，徐 蕾，李铁臣

(皖南医学院 1.分子生物学研究室;2.生化与分子生物学教研室，安徽 芜湖 241002)

妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)是一种妊娠期特有的可逆的肝脏疾病，临床以孕妇皮肤瘙痒、血清胆酸和转氨酶升高为特征［1］。一般在妊娠晚期发病，产后恢复正常，40% ～60%的患者再次妊娠时复发［2］。ICP主要危害胎儿，可导致胎儿宫内窘迫、早产或死胎等［1］。ICP病因不明，已有研究表明，ABCB4(ATP-binding cassette，subfamily B，member 4，ABCB4)基因的突变可能与ICP发生相关，其外显子6是突变热点之一［3-4］。本实验采用聚合酶链式反应(PCR)技术结合DNA序列测定，检测12例ICP患者，以期进一步了解中国人群中ABCB4基因的外显子6的突变情况与ICP发病的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料 ICP病例诊断参考《妇产科学》［5］:皮肤瘙痒;血清胆酸、血清谷丙转氨酶或谷草转氨酶活性显著升高;流行性病毒标志物均为阴性;无其他能引起瘙痒、黄疸和肝功能异常的疾病。12例ICP患者EDTA抗凝血均来自2009年9月～2012年1月皖南医学院附属弋矶山医院妇产科的住院患者，彼此无亲缘关系。年龄23～30岁，平均为(26.08±2.35)岁。分娩(或剖宫产)前抽取孕妇外周血2 ml，-20℃冻存。

1.2 研究方法

1.2.1 提取基因组DNA 采用本实验室常规酚-氯仿方法抽提12例ICP患者的外周血DNA标本，4℃保存、备用。

1.2.2 聚合酶链式反应(PCR) 外显子6的引物序列由Primer 5.0软件设计并在NCBI网站上进行BLAST验证(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，无误后，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列、产物大小及复性条件见表1。

PCR 扩增体积 50 μl:ddH2O 40μl，10×buffer(含 Mg2+)5 μl，dNTPs(0.2 mmol/L)1 μl，上游及下游引物各 0.5 μl，模板DNA 2 μl，Taq酶(Tiangen公司产品，版本号:PR110413)1μl。PCR反应在热循环PCR仪(美国MJ公司产品)上进行，反应条件为:98℃预变性5 min后，94℃变性30 s(在94℃变性20 s时加入Taq酶，进入热循环扩增)、63℃退火45 s、74℃延伸 l min，35 个循环后，74 ℃延伸4 min。反应终止后，短暂离心，吸取PCR扩增产物取10μl加样，经溴化乙锭染色过的1.0%的琼脂糖凝胶电泳30 min(电压100 V)，生物电泳图像分析系统观察结果，拍照保存。PCR产物-20℃保存备用。

1.2.3 DNA的测序 电泳证实有目的条带的扩增产物经AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司产品)纯化，纯化后的PCR产物30μl同外显子6的下游引物一起寄到北京诺赛基因组研究中心进行测序，测序返回结果在NCBI网站进行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)比对确认。

表1 PCR引物序列和退火条件Tab 1 PCR primers and anneal conditions

2 结果

2.1 PCR扩增结果 对12例ICP患者的DNA标本进行ABCB4基因外显子6的PCR扩增，目的片段大小为255 bp，12例标本均扩增出目的片段(图1)。

图1 ABCB4基因外显子6的PCR扩增产物M:100 bp DNA Ladder Marker，从下至上:100 bp、200 bp、300 bp、…;泳道1～11:ICP病例标本PCR产物Fig 1 PCR products of ABCB4 gene exon 6M:100 bp DNA ladder marker;1-11:ICP patients

2.2 DNA测序结果 发现7例ICP患者ABCB4基因第504位碱基发生变化，其中3例为c.504C＞T杂合突变，4例为c.504C＞T纯合突变(图2～4)，为第168位天冬酰胺同义突变。

3 讨论

ICP病因尚不明确，临床和流行病学研究表明其与激素、遗传和环境等因素相关［1-2］。ABCB4基因又称为多药耐药3(multidrug resistance 3，MDR3)基因，位于人类染色体7q21.1，编码P-型糖蛋白，该蛋白介导肝细胞小管膜上的磷酸卵磷脂的跨膜转运［1］。当ABCB4基因发生突变时，造成编码的糖蛋白丢失或功能丧失从而使胆道内磷脂浓度降低，缺乏磷脂的胆汁成分可能导致胆管受损造成胆石沉积，诱发炎症进而导致不同肝脏疾病发生［6］。自Jacquemin等［3］首次发现 ABCB4基因突变可能与ICP的发生有关以来，多个ABCB4基因突变在ICP患者中被发现［7-10］。ABCB4基因序列突变被认为与ICP的易感性相关［10］。

图2 ABCB4基因外显子6无突变DNA测序图，共5例Fig 2 DNA Sequencing of ABCB4 gene exon 6 absent of mutation(Totally 5 cases)

图3 ABCB4基因外显子6内c.504 C＞T杂合性突变DNA测序图，共3例Fig 3 DNA Sequencing of ABCB4 gene exon 6 with c.504 C＞T heterozygous(Totally 3 cases)

图4 ABCB4基因外显子6内c.504 C＞T纯合性突变DNA测序图，共4例Fig 4 DNA Sequencing of ABCB4 gene exon 6 with c.504C＞T Homozygous(Totally 4 cases)

本实验采用PCR和DNA测序方法，对安徽省皖南地区12例ICP患者标本的ABCB4基因外显子6的突变情况进行了研究。结果发现7例ICP患者ABCB4基因的外显子6发生碱基变化，其中3例为c.504C＞T杂合突变，4例为c.504C＞T纯合突变。该位点的胞嘧啶碱基转换为胸腺嘧啶，导致了一个天冬酰胺的同义突变(p.Asn168Asn)。此结果与Bacq［7］［8］

同义突变是指DNA一级序列发生单个碱基的置换。由于遗传密码子的简并性，单个碱基被替换之后，产生的新密码子编码的氨基酸种类不变。Lenski等［11］通过体内外的定量表达研究发现，同义突变后剪切转录本的比率不同于正常对照组，野生型片段的减少导致蛋白表达量降低进而导致疾病的发生。

综合我们的实验结果及其他研究报道，我们认为ABCB4基因外显子6的同义突变与ICP的发生有一定关联，两者间的相关性值得做进一步研究。

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