植物黄芪根内生真菌的分离1)

马 伟 贾艳姝 李 娜 龚 贺 张艳贺

(黑龙江中医药大学，哈尔滨，150040)

蒙古黄芪［Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］为名贵中药材。但目前对其过度的采挖，已造成传统道地黄芪已远远不能满足市场需求［1－2］。因此从天然药用微生物的角度出发，分离有价值的黄芪内生真菌对保护野生资源具有重要意义［3－7］。

1 材料与方法

1.1 仪器及试药

试验仪器:FA2004型电子分析天平(上海良平仪器仪表有限公司);DZKW－C型仪表恒温不锈钢水浴锅(上海樹立仪器仪表有限公司);手提式压力锅(上海申安医疗器械厂);CLASSⅡTYPE B2洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司);HZQF160震荡培养箱(中国哈尔滨市东联电子科技开发有限公司);隔水式恒温培养箱(上海－恒科技有限公司);Nikon－80i显微镜(JAPAN);平板培养皿、三角瓶(上海五一玻璃仪器厂)。

试验试药:牛肉膏、酵母提取物、胰化蛋白胨、蛋白胨、可溶性淀粉(北京奥博星生物技术有限责任公司);琼脂(JAPAN.OXOID ENGLAND);葡萄糖(分析纯，天津基准化学试剂有限公司);医用酒精(齐齐哈尔市鹤城消毒剂厂)。

植物材料为蒙古黄芪［Astragalus membranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao］的健康植株，采集时间为2009年10月，采集地点为黑龙江省农科院园艺分院黑龙江中医药大学黄芪试验田。

1.2 方法

1.2.1 试剂的制备

PDA(A)——PDA粉末与蒸馏水配制而成;牛肉膏蛋白胨固体培养基(B)——牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCI 5 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH=7.4 ～7.6;LB(Luria－Bertani)固体培养基(C)——胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂20 g;高氏 I号培养基(D)——可溶性淀粉 20 g，KNO 31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，蒸馏水1000 mL，琼脂20 g，pH=7.4 ～7.6。

1.2.2 内生真菌的分离纯化及培养基的筛选

组织培养:选择无病斑新鲜黄芪根块冲洗干净，晾至表面无水珠，取主根切成约3 cm长的小段，注意保持切口的整齐。

培养组织表面消毒:自来水冲洗干净，75%乙醇漂洗3 min，无菌水冲洗3次，10%的次氯酸钠溶液浸泡7 min，无菌水冲洗3次，每次2 min。为检查材料表面消毒是否彻底做对照实验如下:①接组织块:将与上述同样条件处理过的根段不作分割，直接种植在4种培养基平皿上，置于相同条件下培养;②接洗涤水:将最后一次清洗消毒组织块的无菌水0.1 mL涂于4种培养基表面，置于相同条件下培养，③直接印迹:将与上述同样条件处理过的根段直接在4种培养基表面做印迹。

培养基的选择:将上述处理过的根段在无菌条件下切去两端，剩余部分分割成小片，随机将小片分别种植于4种培养基平板上，每种培养基设3个平行皿，每皿4片，置于30℃恒温培养箱中培养3～7 d，并以4种空白培养基做对照。空白对照做3种处理，一是不做任何处理;二是将培养基内接入消毒时要使用的同等条件下灭菌的无菌水少许;三是在消毒操作过程中，将倒入培养基的培养皿开盖暴露于超净台内，目的是为了验证培养基、无菌水和超净台灭菌是否彻底。

分离菌的培养:观察实验培养皿及对照皿情况，随时观察出菌情况及组织片变化，待根组织边缘长出菌后，挑取菌丝或菌体，经平板划线法和平板稀释法反复分离、纯化，培养观察菌落的形态，比较4种培养基对黄芪内生真菌的分离情况，并对菌落的生长及特征做相应的记录。将所得菌株编号，转入相应斜面培养基培养16 h，放入4℃冰箱短期保藏，备用。

1.2.3 内生真菌的形态学鉴定

采用湿室法制备标本片:对培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、蒸馏水、PDA培养基等试剂和器皿进行消毒灭菌处理，在培养皿中放入两片盖玻片(距离约为10 mm)，并放入无菌水适量，备用。在固体培养基尚未凝固前，用盖玻片沾取培养基，使其表面形成一层薄的培养基;并将盖玻片置于培养皿中的盖玻片上，形成桥状。挑取少量待测菌株菌丝，接种于盖玻片上，培养2～3 d，将盖玻片转移到灭菌的载玻片上镜检观察并拍摄显微图像。根据菌株的培养性状和显微图像，结合真菌分类鉴定相关文献进行初步分类。

2 结果与分析

2.1 表面消毒效果

实验确定了黄芪根块的最佳表面消毒方式，即先在75%乙醇中漂洗3 min，后用10%的次氯酸钠溶液浸泡消毒7 min，空白对照应选择印迹法或接洗涤水法。在上述表面消毒操作中，所有空白培养基及印迹法和接洗涤水法在整个观察过程中均未染菌;而接组织块法中，在第5天后，组织块两端有时会有菌长出。

2.2 培养基的选择

在上述分离纯化操作中，在PDA培养基中得到内生真菌19株，LB(Luria－Bertani)固体培养基中得到内生真菌6株，高氏I号培养基中得到内生真菌1株，牛肉膏蛋白胨固体培养基中得到内生真菌2株;菌株在PDA培养基中长势最好，且分离得到的内生真菌数量最多(表1)。用4种不同的培养基进行黄芪内生真菌的分离时，PDA培养基无论是在提取菌的数量上，还是在菌的生长状态上都要明显好于其他3种培养基。因此，确定PDA培养基为本实验最佳的提取分离黄芪内生真菌的培养基。

表1 各菌株在各自提取培养基上培养96 h时的菌落形态特征

3 结论与讨论

本研究共从黄芪根块中共分离出28株内生真菌，采用形态学鉴定和分子生物学鉴定相结合的方式，对所有的内生真菌进行了分类鉴定。结果在28株黄芪内生菌中，镰孢菌属19株，生赤壳属3株，裸胞壳属2株，枝穂霉属、枝顶孢属、青霉属及曲霉属各1株。

在材料表面消毒过程中，用同样操作方法对材料表面消毒后，采取3种不同的方法验证表面消毒效果。结果发现，印迹法和接洗涤水法在整个培养过程中均未染菌，而接组织块法中，在第5天后，组织块两端有时会有菌长出。如果其他操作不变，将次氯酸钠消毒时间延长至10 min时，)组织块两端依然会有不同程度染菌。因此，这不能表明表面消毒不彻底。接组织块在第5天后两端染菌，原因可能是表面消毒过程中，消毒液使组织块失活或部分失活，加之材料经过了连续5 d 28℃的培养，导致组织块内部水分或其他液体从组织块两端渗出，材料中的内生菌也随之外渗，使组织块两端染菌。因此，在提取内生菌的研究中，根据材料的不同，采用合理的表面消毒效果验证方法，对于保证内生菌提取的数量和质量具有重要意义。本试验研究表明，验证蒙古黄芪根块表面消毒效果采用印迹法和接洗涤水法效果较好。

在内生真菌的形态学鉴定过程中，采用湿室法制片后，镜下观察时没有加盖盖玻片，有效地保护了菌丝和孢子的形态结构，取得良好的观察效果。

［1］陈聪颖，陆阳，陈泽乃.内蒙黄芪的研究概况［J］.中草药，2001，32(6):567－569.

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［3］谷苏，邵华，蒋晓华，等.药用植物内生真菌多样性及其活性成分的潜在应用价值［J］.中国药学杂志，2001，36(1):14－15.

［4］何劲，刘蕴哲，康冀川，等.植物内生菌及其在农业和医学上的用途［J］.贵州农业科学.2006，34(3):113－115.

［5］郭良栋.内生真菌研究进展［J］.菌物系统，2001，20(1):148－152.

［6］顾谦群，温江妮，朱天骄，等.药用植物内生真菌——天然活性产物新资源［J］.中国海洋大学学报，2006，36(3):365－369.

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