取材时期对文冠果优树芽启动的影响1)

王 非 孙赟璐

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

李在善

(韩国江原大学山林环境科学学院)

李玉花 李风日 李成德 由香玲

(东北林业大学)

文冠果(Xanthoceras sorbifolia Bunge)又名木瓜、文灯果等，属无患子科文冠果属，独属独种。文冠果不仅树形美观，而且种子含油量达30% ～60%，是北方优良的观赏兼木本油料树种［1］。与其他果树相比，文冠果组织培养再生植株较困难。尽管研究者进行了大量研究工作［2-4］，但目前文冠果的组织培养技术仍处于初级水平［1］，还有大量问题需要解决。芽芽繁殖是最能保持母本优良特性的一种无性繁殖方式。早在1980年，张桂琴等以文冠果嫩茎为材料诱导出了腋芽，提出了其最适离体培养条件［5］。此后，王永明等、王玉珍等也提出了以文冠果侧芽萌发的最适培养条件［6-7］。然而他们对外植体材料的接种时期几乎没有阐述，仅大致描述了材料的状态，如，张桂琴等仅描述了3～7年生的嫩茎和半木质化枝条，王永明等也只说到利用带腋芽的嫩茎段为外植体。这致使他们的研究结论差异较大，也限制了这些结论的实际应用。笔者在上述研究的基础上，主要探讨组织培养不同取材时间的外植体芽(顶芽和腋芽)的启动和生长情况，确定相对准确的芽培养取材时间和状态，从而为文冠果芽培养技术的完善提供一部分内容。

1 材料与方法

1.1 材料来源及取材时间

本研究所用材料来自于黑龙江省安达市人民公园内的约7～10年生文冠果优树。2010年分别于5月10日、6月10日、7月10日取材。5月10日，由于气温较低，新枝还未抽出，所取外植体为顶芽。6月10和7月10日，所取材料为新抽嫩枝的腋芽。

1.2 顶芽和腋芽的萌发接种

外植体消毒:对所取外植体，即文冠果包含顶芽的主枝(长度约为2 cm)及新抽枝条进行同样的消毒处理。先放在饱和洗衣粉水溶液中冲洗，用流水冲洗2～3 h后置于超净工作台上，用75%的酒精消毒30 s，无菌水冲洗 3次，再用 5%次氯酸钠(HClO3)溶液消毒15～20 min，无菌水冲洗3次，倒在无菌培养皿内(垫有无菌滤纸)，准备接种。

外植体接种:对顶芽外植体，首先剪去主枝，剥去顶芽外部鳞片和小叶，取出小芽接种在含有3%蔗糖和不同质量浓度BA(0～2.0 mg/L)和NAA(0～0.5 mg/L)的MS培养基中光培养诱导顶芽萌发。对腋芽外植体，将其切成1.0～1.5 cm长的茎段，接种于含有不同质量浓度BA和NAA培养基中光培养诱导腋芽萌发。

每个含有约40 mL培养基的100 mL容量玻璃三角瓶中接种3、4个上述外植体，不同BA和NAA质量浓度组合处理接种30瓶。

芽萌发数据用SPSS1310统计软件进行差异显著性多重(Duncan)分析。

1.3 萌发芽的继代培养

顶芽或腋芽萌发后，将其切下继代在萌发较好的培养基中，观察并统计萌发芽的生长情况。

1.4 萌发芽的生根

选取上述生长较整齐一致的芽，切取2.5 cm，接种在含 IBA(0.4 ～ 1.0 mg/L)、NAA(0.2 ～ 0.4 mg/L)和2%蔗糖的1/2 MS培养基中诱导生根。4周后统计生根情况。

1.5 培养条件

本试验所用培养均调整pH值为5.8后，在121℃、1.0～1.5个大气压之间灭菌15 min后用于接种。培养室的温度为(23±2)℃，光照由白色日光灯提供，光照时间为白天16h，晚上8h，光照强度为1500～2000 lx。

2 结果与分析

2.1 不同取材时间对芽萌发的影响

5月10日由于东北的气温较低，顶芽还未萌发(如图1A)。接种过程发现所取材料中有约60%顶芽是花芽(图1B箭头所示)。因此，该时期取材会对文冠果未来的果实造成不利影响。6月10日和7月10日接种的腋芽，在培养过程中都发现了一个显著的特点，即大约7～10 d，在接种的叶柄基部(如图1F、图1G中箭头所示)接种的腋芽萌发较快。

培养3周后，统计3个取材时间顶芽、腋芽的萌发情况(如表1)。可以看出5月10日(图1B、图1C)和6月10日(图1D、图1E)取材的顶芽和腋芽在不同植物生长调节剂作用下都有不同程度的萌发，而7月10日所取材都没有萌发(如图1G、图1H)。5月份取材比6月份取材，芽的萌发率更高。同时，芽的萌发与培养基中植物生长调节剂的种类和质量浓度有关，5月份取材的外植体在BA0.1 mg/L和 BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L 的条件下，芽的萌发率分别为88.4%和88.2%，相差不显著;但萌发芽的生长状况差异显著，分别为2.5和2.0 cm。6月份取材的外植体在BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L的条件下，芽的萌发率相对比其他植物生长素条件下的高，约51.3%，萌发芽高为1.5 cm。

图1 不同时期所取文冠果芽的萌发、生长及生根

2.2 萌发芽的继代

上述萌发芽切割下来，按照月份接种到含有BA和NAA的培养条件下进行继代培养。培养过程中发现，芽切割下来很容易玻璃化，继而死亡。培养4周后的继代萌发芽的存活率统计如表2。可见，5、6月份取材获得的芽主要在两种培养条件下(BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L，BA1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L)能存活下来，分别为:70.3%，27.5%，69.5%，20.8%，芽的存活率相差不大;继代较好的培养基条件为BA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L。

表1 不同时期所取外植体在含有不同质量浓度BA和NAA的MS培养基培养3周后的萌发

表2 不同时间取材萌发芽继代培养4周的存活情况

2.3 萌发芽的生根

将萌发芽接种到含有IBA和NAA的生根培养基中诱导生根。培养4周后的生根情况统计如表3。可见，生根率都不高，最高的为24%，其培养条件为 IBA0.8 mg/L+NAA0.4 mg/L。

文冠果生根较困难，本研究中文冠果生根的几种植物生长调节剂配比是查阅了相关的资料确定的。其中关于IBA1.0 mg/L主要参考了王永明等提出的诱导文冠果生根的培养基条件(MS大量元素减半，附加IBA1.0mg/L、蔗糖1.5% 、琼脂均为0.8%，pH 值为 5.8 ～ 6.2［6］，但并未获得理想的结果，生根率只有12%，可能由不定芽的状态、试验条件的差异引起的。本研究中的其他生根条件主要来自程冉试验提出的文冠果生根最佳培养基(MS+IAA1.0 ～ 2.0 mg/L)［8］，但生根率都不高。其他获得理想生根的还有张桂琴等和王玉珍等的研究结果。张桂琴等经实验研究提出文冠果生根的最佳培养基是在 SH培养基上附加 IBA1.5 mg/L、IAA1.0 mg/L，或在MS培养基上附加H培养基的叶酸、生物素等［5］。在转接之前，先将小苗基部切口以上0.3 cm处在酒精IBA溶液(用95%酒精配制成含0.1%IBA的溶液)中速浸几秒钟。经约半个月根即伸长;根系粗壮，侧根多，发根率能达83%。王玉珍等在文冠果组培快繁专利中提出的文冠果最佳生根培养基为:在1/2 MS培养基中添加 IBA0.25～2.0 mg/L，NAA0.5 ～3.0 mg/L，AC0.5 ～ 1.0 mg/L，食用糖15～20 g/L［2］。由于组织培养过程中其他一些微环境和个人操作的差异，同样研究内容在不同的实验室、同一实验室不同操作人之间的结果往往差异很大。由于本试验的材料有限，报道的一些理想生根条件还需要进一步验证和研究。

表3 芽在含有IBA和NAA的1/2MS培养基中培养4周的生根情况

3 讨论

组织培养中外植体状态是培养成败的最关键因素。腋芽和顶芽是离体无性繁殖经常利用的一种材料，由于室外的季节和温度变化，适合组织培养的芽的状态应该是在春天芽开始萌动和刚刚萌发的时候，研究结果也显示了顶芽的萌发和生长优势。在5月初，哈尔滨地区气温已经开始升高，文冠果树木开始萌发，应该是取材的最佳时期。但由于文冠果顶芽中有很大一部分是花芽，而此时从外观上无法区分花芽和腋芽，考虑到此时取材会对母树起破坏作用，所以不建议该时期取材。6、7月份进行的研究，材料都是半木质化的嫩茎，但腋芽萌发差异显著，可能是随着时间的延长，半木质化程度、次生物质的积累等存在差异。

对于腋芽的继代和增殖，到目前还没有查到理想结果的报道，仅尝试了其继代培养的条件，其高效增殖还需进一步研究。

［1］张娜，郭进平.文冠果组织培养技术关键环节研究进展与展望［J］.中国农学通讯，2009，25(8):113-116

［2］顾玉红，高述民，郭惠红，等.文冠果的体细胞胚发生［J］.植物生理学通讯，2004，40(3):311-313.

［3］顾玉红.文冠果体细胞胚胎发生及形态建成机理的研究［D］.北京:北京林业大学，2005:37-37.

［4］藏国忠，陈尚武，张文，等.文冠果子叶同不胚的高效诱导及植株再生［J］.西北林学院学报，2008，23(5):91-94.

［5］张桂琴，徐祥龄，赵志学.文冠果嫩茎组织诱导植株移栽初获成功［J］.林业科技通讯，1980(7):4-5.

［6］王永明，赵静茹，陈颖.文冠果的组织培养［J］.植物生理学通讯，1986(1):42-42.

［7］王玉珍，李霞，张弛.文冠果组培快速繁殖方法:中国，10103226［P］.2007-9-12.

［8］程冉.文冠果的引种、快繁及优质丰产栽培技术体系研究［D］.泰安:山东农业大学，2004:31-32.