青牛胆不定芽诱导及生根培养研究

覃芳妮 卢娟 李莉莉 吴俊 孙熹

摘 要：以青牛胆顶芽和腋芽为外植体，分别采用1/2MS、MS、1/2MS（改良）、MS（改良）、N6、ER、SH培养基为基础培养基，分析添加不同植物生长调节剂及配比对顶芽和腋芽诱导、增殖及生根的影响。结果表明：MS（改良）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L能诱导青牛胆外植体生长;最佳增殖培养基为MS（改良）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L+KT 0.25mg/L，其增殖系数达到6;MS（改良）+NAA 0.5mg/L+2，4-D 0.5mg/L+IBA 0.2mg/L能诱导青牛胆丛生芽生根，其生根率达93.3%。

关键词：青牛胆;顶芽;腋芽;诱导;生根

中图分类号 S567.239文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）10-0021-03

Adventitious Bud Induction and Rooting Culture of Tinosporasagittata（Oliv.） Gagnep.

QIN Fangni et al.

（Yulin Foreserch Research Institute，Yulin 537501，China）

Abstract：The shoot segments of Tinosporasagittata（Oliv.） Gagnep. were used as explants materials， and 1/2MS、MS、1/2MS（improve）、MS（improve）、N6、ER、SH were used as the basic medium to study the effects of different exogenous hormones and their ratios on axillary bud initiation，proliferation and rooting of tissue cultured seedings.The results show that suitable medificient for axillary bud initiation is MS（improve）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L; The optimal proliferation medium for axillay buds is MS（improve）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L+KT 0.25mg/L，and the proliferation coefficient reaches 6; The optimum rooting formula selscted in this study is MS（improve）+NAA 0.5mg/L+2， 4-D 0.5mg/L+IBA 0.2mg/L， the rooting rate is 93.3%.

Key words： Tinosporasagittata（Oliv.） Gagnep.; Terminalbud; Axillarybud; Induce; Rooting

青牛膽（Tinosporasagittata（Oliv.） Gagnep.）为防己科青牛胆属常绿缠绕藤本植物[1]。全球范围内已发现的青牛胆属植物有30多种，我国境内发现的有11种，其中6种具有药用价值[2]。青牛胆的药用价值极高，其块根可以治疗咽喉炎、扁桃体炎、上呼吸道感染、气管炎、口腔溃疡等疾病[3-5];其水、醇提取物能明显阻止因肾上腺素诱导的血糖过高[6]。据报道，青牛胆在抗幽门螺杆菌[7]、抑菌[8]、降血糖[9]、抗肿瘤[10]、抗辐射[11]及改善心脑血管疾病[12]等方面也具有明显的改善作用。由于青牛胆的药用价值极高，近年来野生青牛胆被过度采挖，逐渐成为濒危物种。为满足市场需求，有必要研究青牛胆的无性繁殖及人工栽培技术。为此，笔者对青牛胆快繁技术进行了研究，以期为实现规模化生产提供技术支撑，为建立高效、优质的青牛胆外植体组织培养系统提供参考。

1 材料与方法

1.1 外植体选取 在广西玉林市陆川县大桥镇陆透村，选择生长旺盛、枝条无病虫害的优株，剪取约30cm长并带有腋芽的枝条，放入干净塑料袋密封好，置于冰盒中带回实验室。选用顶芽和未老化的腋芽枝条作为外植体。用自来水冲洗表面尘土，然后置于饱和洗衣粉溶液中7min，之后流动自来水冲洗1h，置于超净工作台备用。

1.2 无菌化处理 用75%酒精消毒0.5、1、2min，然后用无菌水清洗2次，再置于0.1% HgCl2溶液中10、20min，最后用无菌水清洗5次。3个正交试验处理青牛胆外植体，把消毒过的外植体接种到诱导培养基中。该培养基以1/2MS、MS、改良1/2MS、改良MS、N6、ER、SH培养基为基础培养基，附加4g/L高强度琼脂、30g/L蔗糖浓度，用1mol HCl和1mol NaOH把培养基pH调至5.8～6.2，随后把培养基分装到350mL的组培专用广口瓶中，121℃灭菌25min。接种后培养条件为温度（28±2）℃，暗培养7d，然后置于光照强度为1200～1700Lx，光照时间超过10h/d，培养15d。每天观察记录不同消毒方法处理的外植体污染率及外植体生长情况。

1.3 诱导培养基筛选 把消毒过的顶芽、腋芽接种于诱导培养基中，顶芽、腋芽诱导培养基设计的因素及水平为：6-BA 0.5mg/L，NAA 0.25mg/L，以1/2MS、MS、1/2MS（改良）、MS（改良）、N6、SH为基本培养基，添加4g/L高强度琼脂、30g/L蔗糖浓度，每种处理20瓶，每瓶接种1～2个芽，每7d观察记录其诱导情况。

根诱导率（%）=诱导出根的芽数/接入总芽数×100

1.4 添加配比不同激素 将相同条件下得到的大小较一致的丛生芽，在无菌环境下剪取1～2cm转接到增殖培养基中，增殖培养基以1/2MS（改良）、MS（改良）为基本培养基，添加4g/L高强度琼脂、30g/L蔗糖浓度，分别添加6-BA 0.5mg/L、NAA 0.25mg/L、KT 0.25mg/L、NAA 0.25mg/L+KT 0.25mg/L、NAA 0.5mg/L+KT 0.25mg/L、NAA 0.25mg/L+KT 0.5mg/L，共设计8个处理组合，接种10瓶，每瓶1～2个丛生芽，每7d观察记录其生长情况并统计其增殖系数。

[增殖系数=总芽数/接入芽数]

1.5 生根培养 把青牛胆丛生植株（有绿色叶子，长度为3～4cm）接种到生根培养基中。生根培养基以MS（改良）为基本培养基，加入4g/L高强度琼脂、30g/L蔗糖浓度，分别加入植物生长调节剂NAA 0.5mg/L、IAA 0.2mg/L、IBA 0.2mg/L、2，4-D（0.2mg/L、0.5mg/L），共设计8个处理，每个处理30瓶，每7d记录其生长及生根情况。

1.6 培养条件 除另外说明外，无性繁殖试验所用到的1/2MS、MS、1/2MS（改良）、MS（改良）、N6、ER、SH培养基为基础培养基，附加4g/L高强度琼脂、30g/L蔗糖浓度，用1mol HCl和1mol NaOH把培养基pH调至5.8～6.2，随后把培养基分裝到350mL的组培专用广口瓶中，121℃灭菌25min。接种后培养条件为温度（28±2）℃，暗培养7d，然后置于光照强度为1200～1700Lx，光照时间超过10h/d，培养周期60d。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对青牛胆外植体污染的影响 由表1可知，不同消毒处理对青牛胆外植体的无菌化具有一定的影响。在酒精和氯化汞处理时间不长的条件下，青牛胆的外植体污染率极高，甚至达到96%;延长酒精和氯化汞消毒处理时间对青牛胆外植体无菌化具有显著作用，但消毒时间较短或过长的情况下，青牛胆外植体污染率均有所增加。由此可见，对青牛胆外植体无菌化最佳的消毒方法为：用75%酒精消毒2min，然后用无菌水清洗2次，之后放到0.1%氯化汞的玻璃瓶中消毒20min，期间不断振动，以便外植体灭菌彻底，最后用无菌水清洗5次。

2.2 不同培养基对青牛胆外植体诱导培养的影响 由表2可知，1/2MS培养基、MS培养基、改良1/2MS培养基、改良MS培养基对青牛胆无菌化的外植体都具有诱导作用，但改良MS培养基中的生长情况最好，其嫩芽生长明显，叶片翠绿，植株增高。

2.3 不同激素配比对青牛胆丛生芽增殖的影响 由表3可知，青牛胆丛生芽在处理F的增殖效果最好，即在改良MS培养基中加入6-BA 0.5mg/L和NAA 0.25mg/L+KT 0.25mg/L，丛生芽增殖系数增大，茎部增粗，植株长势良好，生命力旺盛，基部平均有5～6个分枝。由此可见，6-BA和NAA不同的浓度组合与KT不同的浓度组合作为植物生长激素，对青牛胆丛生芽生长、增殖均能产生不同的影响，其中增殖最高的培养基为MS（改良）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L+KT 0.25mg/L，诱导出的植株生长最快，分枝最多，植株最高。

2.4 不同生长激素配比对青牛胆生根的影响 待丛生芽长出完整叶子后，接种到含有不同生长激素的生根培养基中，20d后统计根诱导率和每个丛生芽的根条数。由表4和图1可知，在NAA和2，4-D浓度相同的情况下，IBA较IAA对青牛胆生根效果更好，其诱导率和诱导出的根数均较IAA高。由此可见，最适合青牛胆生根诱导的培养基为MS（改良）+NAA 0.5mg/L+IBA 0.2mg/L+2，4-D 0.5mg/L。

3 结论与讨论

植物细胞在理论上都存在全能性，任何植物的器官或者组织都能作为组织培养的外植体[13]。青牛胆的顶芽和腋芽可以通过组织培养的方式诱导丛生芽增殖及生根，长成一棵完整的苗。这与葛晓改[14]等以大黄藤（与青牛胆同为防己科植物）茎尖作为外植体，陈加利等[15]以嫩芽组织培养出宽筋藤（与青牛胆同为防己科植物）诱导分化成新植株的结果保持一致。

外植体表面灭菌一般采用酒精、次氯酸钠、氯化汞及高锰酸钾等通过不同组合进行。氯化汞处理时间过短，杀菌不彻底，易导致外植体污染严重;时间过长则会对组织细胞起到杀伤作用[16]。本研究结果表明，青牛胆外植体最佳的消毒方法是用饱和洗衣粉水浸泡7min，流动自来水冲洗1h，然后经过75%酒精消毒5min，过2次无菌水，置于0.1% HgCl2 溶液中20min，最后用无菌水清洗5次。该方法污染率低，并有利于青牛胆外植体转接。

MS（改良）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L能诱导青牛胆顶芽和腋芽外植体生长。最佳增殖培养基为MS（改良）+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.25mg/L+KT 0.25mg/L，其增殖系数达到6。说明KT对青牛胆的增殖具有明显作用，在没有KT的情况下青牛胆增殖系数低，随着KT浓度的增加其增殖系数也有所提高。MS（改良）+NAA 0.5mg/L+2，4-D 0.5mg/L+IBA 0.2mg/L能诱导青牛胆丛生芽生根，其生根率达93.3%。说明IBA较IAA更能促进青牛胆不定芽生根。在NAA和2，4-D浓度相同的情况下，IBA较IAA对青牛胆生根效果更好，其诱导率和诱导出的根数均较IAA高。

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（责编：徐世红）