HMGB1调控区Jurkat稳定细胞株的构建①

2012-09-18 06:04:12张晨光王辉牛志国时慧森尹明梅王雪平胡亚会郑融融孔海瑞胡丽华华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科武汉430022
中国免疫学杂志 2012年10期
关键词:报告基因细胞株荧光素酶

张晨光 王辉 牛志国 时慧森 尹明梅 王雪平 胡亚会 郑融融 孔海瑞 陈 仪 胡丽华(华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科,武汉430022)

HMGB1调控区Jurkat稳定细胞株的构建①

张晨光 王辉②牛志国②时慧森③尹明梅③王雪平③胡亚会③郑融融③孔海瑞③陈 仪③胡丽华(华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科,武汉430022)

目的:构建不同长度的高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因调控序列的真核表达载体及其稳定表达的Jurkat细胞株,为研究HMGB1基因在白血病发病机制建立基础。方法:以Jurkat细胞基因组为模板,PCR扩增3'端固定的8个不同长度的HMGB1调控基因(-83 bp~+83 bp、-383 bp~+83 bp、-504 bp~+83 bp、-688 bp~+83 bp、-975 bp~+83 bp、-1 163 bp~+83 bp、-1 327 bp~+83 bp、-1 520 bp~+83 bp),均将其连入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌DH5a。对氨苄青霉素筛选的阳性克隆进行扩增、质粒抽提,应用KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序获得序列正确的阳性克隆,然后再经酶切连入pGL3-neo-luc质粒,成功构建HMGB1基因调控序列报告基因pGL3-HMGB1-luc(按由短至长顺序依次命名为1~8号质粒)。利用脂质体介导的方法将不同长度的pGL3-HMGB1-luc质粒和pGL3-neo-luc质粒分别转染至Jurkat细胞,48小时后加入终浓度600 μg/ml的G418进行药物加压筛选,20天后得到有效转染pGL3-HMGB1-luc及pGL3-neo-luc载体的Jurkat细胞株(按有无HMGB1调控基因及其由短至长顺序,依次命名为NEO细胞和1~8号细胞)。通过检测荧光素酶活性,验证构建的Jurkat稳定细胞株(Jurkat-HMGB1)。结果HMGB1调控基因成功插入到pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位点之间构建出3号质粒;HMGB1调控序列1016 bp定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和XhoⅠ位点之间,成功构建出8号质粒;将166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp长度的HMGB1调控基因定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和HindⅢ位点之间,分别构建出1号、2号、4号、5号、6号、7号质粒。8个质粒均经KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切,电泳显示条带与扩增的HMGB1调控序列长度一致。HMGB1-T载体的DNA测序结果与NCBI提供序列完全匹配。成功构建了不同长度的3'端固定的pGL3-HMGB1-luc报告基因。pGL3-neo-luc和pGL3-HMGB1-luc稳定转染至Jurkat细胞后,成功构建了NEO细胞和稳定细胞株HJ1~8,其荧光素酶发光值分别为:123、151 288、136 057、110 623、100 874、214 523、147 597、161 348、145 490。结论:构建的HMGB1调控序列报告基因和HJ稳定细胞株为找寻有意义的HMGB1调控区域,以及后期研究HMGB1基因在成人T淋巴细胞白血病中的发病机制奠定了基础。

HMGB1调控基因;Jurkat细胞;报告基因;稳定转染

人高迁移率族蛋白1(High mobility group box1,HMGB1)是一种广泛存在于真核生物细胞内的非组蛋白染色质核蛋白,一种重要的晚期炎症介质。近年来研究发现,HMGB1在多种肿瘤细胞中高表达,其中也包括淋巴瘤细胞、部分白血病患者骨髓细胞,同时HMGB1与肿瘤的浸润、转移及临床分期均密切相关[1-3]。成人T淋巴细胞白血病(Adult T cell leukemia,ATL)是成人T淋巴细胞白血病病毒1型(Human T cell leukemia virus type 1,HTLV-1)感染后导致的血液肿瘤,其中病毒蛋白Tax扮演着关键角色,为便于以后研究HMGB1在成人T淋巴细胞白血病中的作用,以及Tax蛋白对HMGB1的调控影响,笔者构建不同长度的HMGB1调控序列的基因真核表达载体,并转染至人淋巴细胞瘤细胞(Jurkat),筛选并成功构建了其Jurkat稳定细胞株。

1 材料与方法

1.1 材料T淋巴细胞系Jurkat E6-1细胞购于美国ATCC;报告基因pGL3-neo-luc质粒由郑州大学赵国强教授惠赠;pSV-β-galactosidase质粒购自Promega公司;pMD18-T载体、T4连接酶、限制性内切酶均购自大连宝生物,RPMI1640培养基、G418购自Invitrogen公司;胎牛血清购自杭州四季青;胰蛋白胨和酵母提取物购自英国OXOID公司;Taq酶、pfu高保真酶、DNA Marker III、PCR及DNA回收纯化试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、基因提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司,脂质体TransFast、荧光素报告基因检测试剂盒、β-Gal检测试剂盒购自Promega公司。所用引物(3'端固定)均由上海生工公司合成(见表1)。大肠杆菌DH5α由本室保存。构建的质粒均由北京英骏生物公司进行序列测定。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primers used in PCR

1.2 实验方法

1.2.1 HMGB1-3调控序列(587bp)荧光素酶报告基因(pGL3-HMGB1-3-luc)的构建参考NCBI中的HMGB1的调控序列自行设计HMGB1-8的引物,以Jurkat细胞基因组DNA为模板,扩增片段大小为1 603 bp。扩增条件为:95℃预变性10分钟,94℃变性30秒,45℃退火3分钟,72℃延伸3分钟,30个循环,最后72℃延伸10分钟,扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯下观察结果。1 603 bp的扩增片段经纯化后连入pMD18-T载体,即为HMGB1-8-T载体(北京英骏生物公司测序)。而后HMGB1-8-T载体和pGL3-neo-luc均经XhoⅠ和HindⅢ酶切3小时后,凝胶回收HMGB1目的基因(587 bp)和载体pGL3-neo-luc酶切后片段,用T4连接酶将目的基因片段定向克隆至pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位点之间,即为pGL3-HMGB1-3-luc(简称3号质粒)。

1.2.2 HMGB1-8调控序列(1 603 bp)荧光素酶报告基因(pGL3-hgmb1-8-luc)的构建以3号质粒作为载体,同时与hgmb1-8-T载体用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切,凝胶回收酶切后3号质粒的大片段载体(含有587 bp的hgmb1调控序列)和T载体的1 016 bp目的片段,用T4连接酶将目的片段(1 016 bp)定向克隆至酶切后的3号质粒(含有587 bp的hgmb1)KpnⅠ和XhoⅠ位点之间,即获得pGL3-hgmb1-8-luc荧光素酶报告基因(简称8号质粒)。

1.2.3 HMGB1-1、2、4、5、6、7调控序列(166、466、771、1058、1 246、1 410 bp)荧光素酶报告基因的构建:以8号质粒DNA为模板,分别扩增不同长度的调控序列片段(166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp),目的片段均连入pMD18-T载体,测序正确后,把各自对应的T载体和3号质粒经KpnⅠ和HindⅢ酶切,用T4连接酶将各自对应的目的基因片段定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和HindⅢ位点之间,即获得pGL3-HMGB1-1-luc、pGL3-HMGB1-2-luc、pGL3-HMGB1-4-luc、pGL3-HMGB1-5-luc、pGL3-HMGB1-6-luc、pGL3-HMGB1-7-luc荧光素酶报告基因(依次简称为1、2、4、5、6、7号质粒)。

1.2.4 细胞培养、转染、阳性克隆筛选及细胞株构建Jurkat细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基(内含100 U/ml青霉素,100 μg/ml链霉素)在37℃、5%CO2、相对湿度90%的培养箱中培养,2~3天传代1次,调整细胞密度不超过5×106ml-1。当细胞处于对数生长期时,利用脂质体介导的方法将8个pGL3-HMGB1-luc和pGL3-neo-luc质粒分别转染Jurkat细胞中,质粒均为0.3 μg,详细转染步骤见说明书和文献[4]。转染48小时后,开始进行阳性克隆筛选[5],将细胞以1∶10的稀释比例转到新鲜的RPMI1640培养液中,在培养液中加入筛选剂G418(终浓度为600 μg/ml)继续培养,以正常培养的Jurkat细胞加入G418为对照,待对照组细胞全部死亡(约20天),挑取单个细胞克隆至24孔培养板,用含G418(300 μg/ml)的RPMI1640培养液继续克隆筛选扩增,持续加药筛选2个月以上,在对数生长期时收集并调整细胞浓度为6×106ml-1,取其100 μl检测荧光素酶活性,验证构建的Jurkat-HMGB1稳定细胞株。每组设三个复孔,实验重复三次。构建的细胞株依HMGB1调控片段的有无和长短依次命名为1~8号细胞和NEO细胞。

2 结果

2.1 HMGB1调控序列真核表达载体构建将587 bp的HMGB1调控序列插入到pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位点之间,成功构建出3号质粒;将hgmb1调控序列587 bp的上游片段1 016 bp定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和XhoⅠ位点之间,成功构建出8号质粒;将166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp的hgmb1调控序列定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和HindⅢ位点之间,构建出1、2、4、5、6、7号质粒。8个质粒均经KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切,电泳显示条带与扩增的hgmb1调控序列长度一致,如图1所示(图1B中因1 603 bp中含有HindⅢ酶切位点,pGL3-neo-luc含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点,故其切出三个条带)。HMGB1调控序列T载体的DNA测序结果与NCBI提供序列完全匹配(图2),说明不同长度的HMGB1调控序列荧光素酶报告基因构建成功。

图1 HGMB1调控序列荧光素酶报告基因(pGL3-HMGB1-luc)的酶切鉴定Fig.1 The identification of pGL3-HMGB1-luc recombinant plasmid

2.2 HMGB1调控序列Jurkat稳定细胞株的构建不同长度HMGB1调控序列真核表达载体(pGL3-HMGB1-luc)稳定转染至Jurkat细胞中,检测胞浆中的荧光素酶发光值分别为:123、151 288、136 057、110 623、100 874、214 523、147 597、161 348、145 490(自左至右依次为NEO细胞和1~8号细胞),验证细胞系构建成功。

图2 HMGB1调控序列(1 603 bp)的测序峰图Fig.2 DNA sequencing map of recombination plasmid

3 讨论

人类HMGB1基因定位于13q12染色体上,HMGB1是细胞核内一种高度保守高丰度的非组蛋白类染色体结合蛋白,是由单一基因编码的结构性转录因子,主要通过与DNA结合而参与DNA的复制、转录调控、V(D)J重组、修复、细胞分化及基因表达等多种细胞核生命活动[1,2]。HMGB1具有3个结构域,2个同源的L型DNA结合区A box、B box和1个富含天冬氨酸和谷氨酸、带负电荷的C端酸性尾。A box和B box与DNA具有很高的亲和力,前者是引起炎症反应的功能结构域,而A box能够特异拮抗B box的功能,具有类似HMGB1抗体的功能而竞争性抑制HMGB1的致炎作用,C区具有调节HMGB1与DNA的亲和力的作用。生理情况下,HMGB1蛋白组成性表达于所有细胞中。低分化的细胞核中HMGB1高表达,分化成熟的细胞核中HMGB1含量下调甚至检测不到。HMGB1具有多种生物学功能,可作为一种炎性细胞因子,由损伤坏死的细胞被动释放或活化的单核巨噬细胞主动分泌,并且可再度激活巨噬细胞,产生一系列的病理生理作用[6,7],被认为是一种重要的“晚期炎症介质”。最近发现,HMGB1蛋白在多种肿瘤细胞包括肝癌、结肠癌、淋巴瘤、部分白血病患者骨髓细胞中表达丰富,具有转录因子和促生长因子的作用,与肿瘤细胞的生长、凋亡、浸润和转移等病理生理过程有关[8,9]。

Jurkat为人淋巴细胞瘤细胞,来源于人急性T淋巴细胞白血病,该细胞不含有HTLV1,因此选择该细胞株为研究Tax蛋白对HMGB1调控的影响提供了帮助[10]。为了研究HMGB1在ATL中的作用,本研究成功构建了HMGB1调控序列真核表达载体,并稳定转染至白血病细胞株Jurkat细胞中,筛选并成功构建了过表达HMGB1调控基因的稳定细胞株。这些HMGB1调控序列真核表达载体和HMGB1-Jurkat稳定细胞株为找寻起作用的HMGB1调控区域,以及阐明Tax蛋白对HMGB1调控的影响和HMGB1基因在ATL的发病机制奠定了基础。

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3 Meyer A,Staratschek Jox A,Springwald A et al.Non Hodgk in lymphom a expressing high levels of the danger signalling protein HMGB1[J].Leuk Lymphoma,2008;49(6):1184-1189.

4 牛志国,余志豪,陈丽媛et al.T细胞白血病病毒1型Tax蛋白阳性细胞中早期生长反应基因-1对NF-κB活性的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志,2011;31(6):532-536.

5 夏云,石瑛,高琰et al.Tax基因表达细胞系的建立及其生物学活性的初步研究[J].中国实验血液学杂志,2008;16(6):1425-1429.

6 Daolin Tang,Rui Kang,Chun-Wei Cheh et al.HMGB1 Release and Redox Regulates Autophagy and Apoptosis in Cancer Cells[J].Oncogene,2010;29(38):5299-5310.

7 Reiss L K,Uhlig U,Uhlig S.Models and mechanisms of acute lung injury caused by direct insults[J].Eur J Cell Biol,2012;91(6-7):590-601.

8 Yan W,Chang Y,Liang X et al.High mobility group box 1 activates caspase-1 and promotes hepatocellular carcinoma invasiveness and metastases[J].Hepatology,2012;55(6):1863-1875.

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10 Matsuoka M,Jeang K T.Human T-cell leukemia virus type 1(HTLV-1)and leukemic transformation:viral infectivity,Tax,HBZ and therapy[J].Oncogene,2011;30(12):1379-1389.

[收稿2012-03-30 修回2012-06-26]

(编辑 倪 鹏)

Establishment of HMGB1 regulatory gene stable sublines of Jurkat cells

ZHANG Chen-Guang,WANG Hui,NIU Zhi-Guo,SHI Hui-Sen,YIN Ming-Mei,WANG Xue-Ping,HU Ya-Hui,ZHANG Rong-Rong,KONG Hai-Rui,CHEN Yi,HU Li-Hua.
Laboratory of Clinical Medicine,Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan430022,China

Objective:To construct and identify luciferase reporter gene vectors containing different-length human high mobility group box 1(HMGB1)gene regulatory sequence and stable expression cell strains of Jurkat cells(Jurkat-HMGB1),so as to lay a foundation for the further exploring the role of HMGB1 regulatory gene in the pathogenesis of adult T cell leukemia(ALT).Methods:HMGB1 gene regulatory sequences(-83 bp~+83 bp,-383 bp~+83 bp,-504 bp~+83 bp,-688 bp~+83 bp,-975 bp~+83 bp,-1 163 bp~+83 bp,-1 327 bp~+83 bp,-1 520 bp~+83 bp)were amplified by PCR with DNA as template from Jurkat cells,in which 3’-flanking region were fixed.HMGB1 regulatory genes were ligated into pMD18-T vector respectively and then transformed into E.coli strain DH5a,grown on LB agar plate supplemented with 100 μg/ml ampicillin overnight.The single ampicillinselected DH5a clone was picked for plasmid extraction.The extracted plasmids were digested with the desired restriction enzymes of KpnⅠ/HindⅢor BamHⅠ/HindⅢ.The correctness of HMGB1 regulatory sequence was confirmed with DNA sequencing.The insert of HMGB1 contained in pMD18-T vector was cut out with restriction enzymes(KpnⅠ/HindⅢ)and then ligated into vector pGL3-neoluc to form pGL3-HMGB1-lucs,named according to the length of HMGB1 from short to long in order.PGL3-HMGB1-lucs and pGL3-neo-luc were transiently transfected into Jurkat cells mediated by liposome for 48 hours,the cells were then cultured with G418 at a final concentration of 600 μg/ml for over 20 days.Finally stably transfected sublines of Jurakt cells were obtained after 20 days.And efficiency and validity of stable sublines of HMGB1-Jurkat were testified by luciferase reporter gene activity.Results587 bp-HMGB1 regulatory sequence was firstly ligated into XhoⅠand HindⅢsites of pGL3-neo-luc to get plasmid 3,1016bp-HMGB1 were then ligated into KpnⅠand XhoⅠsites of plasmid 3 to obtain plasmid 8;and 166 bp-,466 bp-,771 bp-,1 058 bp,1 246 bp,1 410 bp-HMGB1 genes were ligated into KpnⅠand HindⅢsites of plasmid 3 to construct recombinant plasmid 1,2,4,5,6 and 7,respectively.PGL3-HMGB1-lucs were confirmed correctly by digesting of KpnⅠ/HindⅢor BamHⅠ/HindⅢand DNA sequencing of HMGB1-T vectors,consistent with the sequence in NCBI to a large extent.And pGL3-hgmb1-lucs were constructed successfully.Following,Jurkat cells were stablely transfected with plasmid pGL3-hgmb1-lucs and pGL3-neo-luc to construct cell HJ 1-8 and cell NEO successfully validated by luciferase luminescence value,which were 151 288,136 057,110 623,100 874,214 523,147 597,161 348,145 490 and 123,respectively.ConclusionpGL3-hgmb1-lucs and stable sublines of HMGB1-Jurkat established successfully provide a basis for looking for meaningful HMGB1 regulatory region and exploring the roles and mechanisms of HMGB1 used in ATL.

HMGB1 regulatory gene;Jurkat cell;Reporter gene;Stable transfection

R392

A

1000-484X(2012)10-0926-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.10.014

①本文为河南省教育厅重点项目(12A310006)和新乡医院重点研究领域招标课题(ZD2011-13、ZD2011-15)

②新乡医学院医学检验系,新乡453003

③新乡医学院2008级、2009级和2010级本科学生,新乡453003

张晨光(1972年-),女,在读博士,副教授,主要从事分子免疫的研究;

及指导教师:胡丽华(1954年-),女,教授,博士生导师,主要从事分子免疫学方面的研究,E-mail:xh_hlh@126.com。

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