角质细胞生长因子促进大鼠胰腺导管上皮细胞体外增殖

吴 刚，张晓健，白 光

(辽宁医学院附属第一医院肝胆外科，辽宁锦州121000)

胰腺导管上皮细胞(pancreatic ductal epithelial cells，PDECs)可在适宜的条件下增殖分化为胰岛素分泌细胞，是胰岛移植治疗糖尿病(diabetes mellitus，DM)的理想种子细胞。但是，目前还没有一套良好的PDECs培养增殖的实验方案，实现PDECs体外大量增殖成为亟待解决的问题。角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)是一种能特异性促进上皮细胞增殖的生长因子［1－5］，对多种器官具有保护作用，并且在损伤修复过程中大量表达，可通过促进有丝分裂、激活信号通路及调节酶活性等方面促进上皮细胞增殖和迁移作用。本实验以大鼠胰腺组织为材料，建立一种良好有效的PDECs培养增殖方法，并探讨不同浓度的KGF在体外对大鼠PDECs增殖的影响，寻找解决胰岛供体短缺的有效途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠20只，6～7周龄，雌雄不限，体质量250～300 g，辽宁医学院动物实验中心提供［SYXK(辽)2009-0004］。

1.2 主要试剂

KGF、DTZ、V型胶原酶和 CK19单克隆抗体(Sigma公司);Hank's液、0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基(1∶1)和FBS(Gibco公司);DMSO、DAB酶底物显色试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)。

1.3 原代PDECs的分离、纯化和培养

所有大鼠术前禁食12 h，禁水4 h。采用逆行胆管灌注胶原酶法获得细胞。采用不连续密度梯度离心法、差速贴壁法纯化细胞。将部分细胞悬液移入非黏附培养瓶中培养，加入无血清的高糖DMEM/F12培养基(50 μg/L霍乱毒素、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、1 g/L ITS);另将部分细胞培养于放置有盖玻片的培养皿中，行细胞鉴定。

1.4 免疫细胞化学染色法鉴定细胞表面标志物

收集6孔板中的盖玻片(盖玻片上接种有第4代细胞，正处于对数生长期)，PBS(pH=7.4)冲洗，4%多聚甲醛固定，经标准的渗透化处理(0.1%tritonx-100)室温10 min，50 μL正常动物非免疫血清封闭，一抗为50 μL的小鼠抗大鼠CK19单克隆抗体(1∶100)，4℃过夜。二抗为50 μL羊抗小鼠抗体(1∶50)，37℃孵育30 min。苏木素复染，脱水，中性树胶封固。

1.5 RT-PCR检测细胞表面标志

提取细胞总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测，RT-PCR检测Nestin、CK19、Insulin和Glucagon的表达。引物设计序列(表1)。

1.6 PDECs向胰岛素分泌细胞的分化

将第2～3代细胞转入含有低糖培养基的细胞培养瓶中，培养4～6 d。取诱导分化物3 mL，加入

表1 引物设计序列Table 1 Sequence of primer

配制好的终浓度为140 mg/L的DTZ溶液5 μL，轻轻振荡混匀，室温下静止6～10 min，倒置显微镜下观察。分别消化诱导分化前后的细胞，1×105个/mL浓度接种于24孔板。待细胞贴壁生长后，吸净培养液，加入1 mL含2.8 mmol/L糖的D-Hank's液置于培养箱中培养2 h，收集上清液冻存待测基础胰岛素水平;而后加入含16.7 mmol/L糖的D-Hank's液培养1 h，收集上清液采用放射免疫法(RIA法)测定分化前后两种细胞不同糖浓度刺激下胰岛素释放含量。

1.7 不同浓度的KGF对PDECs增殖的影响

消化80% ～90%汇合生长的PDECs，制成细胞悬液，调整细胞浓度为4×105个/L，以100 μL/孔接种于96孔培养板，共3个板，5%CO237℃下培养。分为5组，1～4组加入KGF，使其终浓度分别为5、10、15和20 μg/L;第5组加入等量的 DMEM/F12 作为阴性对照组。每组4个复孔，另设一空白对照组(仅加培养液，不加细胞)，比色时用于调零。绘制KGF促进胰腺导管上皮细胞生长增殖曲线。

1.8 统计学分析

全部数据均用SPSS 17.0软件进行统计学处理。数据采用均数±标准差(±s)表示，实验组与对照组之间比较采用t检验，组间采用方差分析进行两两比较。

2 结果

2.1 原代PDECs的分离、纯化和培养

图1 分离培养的胰腺导管上皮细胞Fig 1 PDECs morphology(×100)

胶原酶灌注胰腺后充盈良好，胰腺各部分膨胀均匀。倒置显微镜下观察可见原代细胞中大量圆形细胞悬浮，细胞形态不一，呈梭形、三角形、楔形等(图1A)。48 h后胰腺导管上皮细胞开始贴壁，呈多型性，并逐渐分裂生长为单层细胞，细胞逐渐融合为“鹅卵石样”结构排列，细胞形态趋向一致(图1B)。通过差速贴壁法及改用无血清培养基培养4 d内，细胞增长缓慢，从第5天开始增殖加速，进入对数生长期，细胞逐渐呈多角形，形态单一，并逐渐汇合成片。培养第10天开始呈上皮细胞样生长，11～13 d左右细胞达80%贴壁(图1C)。

2.2 免疫细胞化学染色检测细胞表面标志物

盖玻片上的单层上皮细胞胞质染色呈棕色，CK19染色阳性率达到(92.4±2.8)%(图2)。

图2 免疫细胞化学染色显示胰腺导管上皮细胞表达CK19Fig 2 Expression of CK19 of PDECs by immunocytochemical stain(×100)

2.3 RT-PCR检测细胞表面标志物

PDECs的 Nestin和 CK19表达阳性，而 Insulin及Glucagon表达阴性(图3)。

2.4 PDECs向胰岛素分泌细胞的分化

图3 RT-PCR检测细胞表面标志物的表达Fig 3 Expression of cell surface marker by RT-PCR

PDECs经低糖培养基诱导分化后，上皮样细胞周围出现大量圆形细胞，并逐渐聚集成细胞团，悬浮于培养液中。在倒置显微镜下观察细胞团呈现圆形或椭圆形，称为类胰岛样结构，经DTZ染色后细胞团呈红色或猩红色(图4)。

图4 胰腺导管上皮细胞经低糖培养基诱导分化为类胰岛样结构Fig 4 PDECs were induced to differentiate into islet-like cells(×100)

10、20和30mmol/L糖浓度下，分化后细胞胰岛素释放量显著高于分化前(P＜0.01)(表2)。

表2 分化前后细胞对不同浓度糖溶液的胰岛素反应能力Table 2 Reaction of PDECs to insulin of different glucose concentrations before and after differention(x ± s，n=8)

2.5 不同浓度的KGF对PDECs增殖的影响

培养基中加入KGF后，MTT法测定不同浓度KGF对PDECs增殖的影响(表3)。

培养2 d时，20 μg/L组细胞数显著高于对照组;6～10 d时，10、15 和20 μg/L组细胞数显著高于对照组(P＜0.01);第12天，20 μg/L组细胞数显著高于对照组(P＜0.05)。倒置显微镜下观察20 μg/L组PDECs均存活，形态正常，细胞密度大，增殖活跃。

3 讨论

目前尚无特异的 PDECs标志物。CK19是PDECs生长发育过程中的重要因子，被认为是PDECs向干细胞转化的标志之一［6－8］。本实验通过免疫细胞化学染色法对第2代导管上皮细胞进行了鉴定，结果发现CK19染色阳性率在90%左右，说明分离的细胞可以表达胰腺干细胞的表面标志，而且RT-PCR结果也显示CK19 mRNA表达阳性。Nestin是否是PDECs的表面标志物还需进一步的研究。本实验仅在基因水平检测到第2代细胞有Nestin表达。

胰腺细胞包括内分泌、外分泌及导管上皮细胞;其中腺泡细胞占82%，胰岛细胞仅占1%。为了排除胰岛细胞的污染，本研究应用RT-PCR检测Insulin和Glucagon的表达，结果显示分离出的细胞为较纯的PDECs，可以作为后续实验的细胞来源。

为了检测分化出的细胞能否分泌胰岛素，本研究设计了不同糖浓度的培养基，用放免法测定分化前后胰岛素分泌水平。结果发现，分化前的PDECs基本无分泌胰岛素的能力，分化后的类胰岛样细胞团对不同糖浓度均有反应能力。从表3可以看出，0～20 μg/L的范围内，在同一时间下，随着KGF浓度的增大，A值逐渐增加，且各组间有差异，说明KGF的增殖作用在本实验所选择的剂量范围内呈浓度依赖性，各浓度组刺激2 d后细胞的增殖最为旺盛。

KGF是一个特异性的促上皮细胞增殖的高效生长因子，对多种器官具有保护作用，在损伤修复过程中大量表达，可通过促进有丝分裂、激活信号通路及调节酶活性等方面促进上皮细胞增殖和迁移作用［9－10］。利用不同浓度的KGF刺激大鼠胰腺导管上皮细胞的增殖，结果显示:培养0～2 d细胞处于潜伏增殖期，细胞增殖活性在各组变化较小;第6天细胞增殖加速，进入对数生长期，6～10 d细胞计数达高峰，KGF各浓度组细胞数显著高于对照组。第12天细胞增殖到达平台期，细胞生长逐渐趋向停滞，但20 μg/L组细胞数仍显著高于对照组，而其他各组细胞数与对照组比较无差异。所以在本实验的剂量范围内，20 μg/L为促进增殖的最佳浓度，该结果或许可为相似研究工作提供参考。

表3 MTT法测定不同浓度KGF对PDECs增殖的影响Table 3 Effects of KGF on cell proliferation shown by MTT(x ± s，n=5)

［1］Movassat J，Portha B．Early administration of keratinocyte growth factor improves{beta}-cell regeneration in rat with streptozotocin-induced diabetes ［J］．J Endocrinol，2007，195:333－340．

［2］Kim A，Lakshman N，Karamichos D，et al．Growth factor regulation of corneal keratocyte differentiation and migration in compressed collagen matrices［J］．Invest Ophthalmol Vis Sci，2010，51:864 －875．

［3］Etheredge L，Kane BP，Hassell JR．The effect of growth factor signaling on keratocytes in vitro and its relationship to the phases of stromal wound repair［J］．Invest Ophthalmol Vis Sci，2009，50:3128 －3136．

［4］Wagner M，Koschnick S，Beilke S，et al．Selective expansion of the beta-cell compartment in the pancreas of keratinocyte growth factor transgenic mice［J］．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，294:1139 －1147．

［5］ Uzan B，Figeac F，Portha B，et al．Mechanisms of KGF mediated signaling in pancreatic duct cell proliferation and differentiation［J］．PLoS One，2009，4:4734．

［6］陈珂玲，周翔宇，李园，等．大鼠胰腺导管上皮细胞中白介素-1受体相关激酶-M的表达及意义［J］．中国微循环，2009，13:272－276．

［7］赵艳艳，庞长河，李志臻，等．胰腺导管上皮细胞来源的胰岛样细胞移植治疗Ⅰ型糖尿病［J］．中华实验外科杂志，2011，28:86－88．

［8］宋莹，赵岳，刘伯纯，等．Slc26a6敲除对小鼠胰腺导管上皮细胞Slc26a3和CFTR表达水平的影响［J］．中国实验诊断学，2011，15:26－29．

［9］赵艳艳，余勤，李志臻，等．胰腺导管上皮细胞转分化为胰岛样细胞［J］．中国组织工程研究与临床康复，2010，14:6064－6067．

［10］纪明明，王康，刘晓雪，等．靶向间皮角质细胞生长因子预防大鼠术后腹膜黏连的实验研究［J］．中华普通外科杂志，2011，26:580－583．