二氯化钴致人结肠癌细胞系CacyBP/SIP核转位

谢福利，仇长青，赵盈盈，杨 博，冯珊珊，翟惠虹*

(1.宁夏师范学院医学院，宁夏固原756000;2.宁夏医科大学临床学院总医院消化内科，宁夏银川750004)

低氧在结肠癌发生过程中具有重要的作用［1］，可促进结肠癌细胞增殖、抑制凋亡及增强化疗耐药［2］，但具体机制不清。CacyBP/SIP自1996年发现以来，越来越多的证据显示［3］:在肿瘤发生、发展、侵袭及转移等方面都有重要的作用;同时，具有依赖Ca2+浓度的核转位现象［4］，核转位后促进结肠癌细胞增殖［5］。低氧是否可诱导CacyBP/SIP核转位?本研究拟通过构建CacyBP/SIP过表达慢病毒颗粒，转染至结肠癌细胞，给予 CoCl2刺激，观察CacyBP/SIP在结肠癌细胞中的定位。

1 材料与方法

1.1 材料

结肠癌细胞SW480(上海中科院);CoCl2(Sigma公司);胞质胞核蛋白抽提试剂盒(Pierce公司);CacyBP/SIP mAb(Cell signaling公司);293T细胞、pGC-LV重组载体、pHelper 1.0和pHelper 2.0(吉凯基因公司);其他相关试剂(Fermentas、SinoBio、Takara、NEB、捷瑞公司)。

1.2 方法

1.2.1 过表达CacyBP/SIP慢病毒载体构建:应用人结肠癌细胞系HCT-116的cDNA序列，采用Primer Premier v5.0软件设计上游和下游引物，用PCR法扩增CacyBP/SIPcDNA序列。带有绿色荧光的慢病毒载体与目的基因分别用NheⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，T4连接酶将酶切后的产物相连，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，应用PCR法筛选阳性克隆，接种阳性转化子，送测序。用 Lipofectamine2000共转染pGC-LV载体和两种辅助包装原件载体至293T细胞包装。培养8h更换为完全培养基，培养48 h后，收集上清液，浓缩后在293T细胞中采用逐孔稀释法测定并标定病毒滴度。

1.2.2 转染结肠癌细胞:常规培养传代，在T50瓶细胞长至30% ～50%时，每瓶加入500 μL(5 mg/L)Polybrene、4 400 μL完全培养基和100 μL(1 ×108个细胞)过表达CacyBP/SIP的慢病毒颗粒，放入培养箱培养8～12 h弃去细胞上清，更换为新鲜培养基继续培养。至细胞长至80%以上汇合时，正常消化传代并行激光共聚焦检测。

1.2.3 激光共聚焦检测:取3个12孔培养板，每孔放置一个细胞爬片，每孔接种(3～4)×104个细胞。至细胞长至最佳状态时，吸干培养基，用PBS冲洗2次，分别加入2 mL含 50、100 及150 μmol/L CoCl2培养基。对照组每孔分别加入完全培养基作为对照。分别在培养箱培养0.5和1 h。用4%多聚甲醛1 mL，固定20 min，PBS冲洗3遍，再用0.1%的 Tritont 100，37℃温箱内打孔45 min，PBS冲洗3遍，最后用含DAPI封片剂染色封片。激光共聚焦检测CacyBP/SIP在细胞中的定位。

1.2.4 Western blot法检测:对于激光共聚焦检测阳性结果(100 μmol/L CoCl2刺激1 h)，胰蛋白酶消化后以500 r/min离心3 min，取细胞沉淀用胞质蛋白、核蛋白抽提试剂盒分别抽提胞质、胞核蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量;上样缓冲液稀释至5 g/L、煮沸后 －80℃冻存;把20 μL蛋白样品上样到12%SDS-PAGE胶加样孔内，电泳电压80 V，时间20 min;湿式转膜，电流200 mA，60 min;加入5%脱脂牛奶封闭60 min后，加入 CacyBP/SIP单抗(1∶200)4℃孵育过夜，常规洗膜后加入羊抗鼠IgG(1∶2 000)的二抗，室温孵育1 h，洗涤。曝光、显影。

2 结果

2.1 构建了过表达CacyBP/SIP慢病毒载体

PCR扩增目的基因(图1);对构建的过表达CacyBP/SIP慢病毒载体阳性克隆进行PCR鉴定(图2)，与目标基因测序比对(图3);绘制熔解曲线(图4)。

2.2 转染结肠癌SW480细胞

将过表达CacyBP/SIP的慢病毒颗粒，转染至结肠癌SW480细胞，复感染指数(MOI)为20，96 h后激光共聚焦观察到绿色荧光(图5)。

2.3 激光共聚焦检测CoCl2刺激前、后CacyBP/SIP在细胞内的定位

无CoCl2刺激条件下 CacyBP/SIP主要位于细胞胞质内;给予100 μmol/L CoCl2刺激0.5 h，CacyBP/SIP位于胞质;刺激1 h时观察到CacyBP/SIP转位至胞核(图6)。

2.4 Western blot检测CoCl2刺激前、后CacyBP/SIP在细胞内的定位

无刺激条件下，CacyBP/SIP主要在胞质内表达，给予100 μmol/L CoCl2刺激1 h，可在细胞核内表达(图7)。

3 讨论

图7 CoCl2刺激前、后 Western blot检测CacyBP/SIP在胞质及胞核中的表达Fig 7 The expressions of CacyBP/SIP in cytoplasm and nuclear under the detecting by Western blot before and after the stimulation of CoCl2

CacyBP/SIP分子质量约26 ku，含一个687 bp的开放阅读框，编码228个氨基酸，存在7个磷酸化位点和1个核定位信号［6］。其功能主要与红细胞的发育［7］和新的泛素-蛋白酶体降解有关［8］。与肿瘤的关系以往研究发现，CacyBP/SIP在胃癌阿霉素耐药细胞中高表达并参与胃癌细胞多药耐药，其下调可以部分逆转耐药性［9］。近年来又发现CacyBP/SIP参与乳腺癌、胰腺癌的发生发展及复发转移，可能成为预后不良的生物学指标之一［10－11］。因此推断CacyBP/SIP与恶性肿瘤的发生发展密切相关。

在前期研究中利用淋巴细胞杂交瘤技术制备了3株CacyBP/SIP单克隆抗体，对正常及肿瘤组织中表达研究发现［12］:CacyBP/SIP在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织，在正常结肠组织不表达，且主要定位于胞质及胞核。

CacyBP/SIP具有依赖 Ca2+浓度的核转位现象［13］。那么，究竟哪些因素可以引起 CacyBP/SIP核转位?

人体肿瘤存在低氧的假设从上世纪50年代年提出，80年代得到证实。肿瘤中的低氧表现为不稳定性。后多家研究证实低氧在结肠癌发生过程中都具有重要作用［14］:低氧可促进结肠癌细胞增殖、凋亡抑制、增强化疗耐药、迁移能力增强。Co2+是铁螯合酶的底物，可替代氧感受器血红素中的Fe2+，在高浓度时与氧结合，将此分子锁定在脱氧合状态，使细胞在不缺氧的环境下“感觉”缺氧。因此本研究用CoCl2刺激来模拟结肠癌低氧，观察低氧状态下CacyBP/SIP是否发生核转位?

本研究通过CacyBP/SIP过表达慢病毒载体转染至结肠癌SW480细胞，激光共聚焦显微镜发现CacyBP/SIP主要位于胞质，Western blot亦证实其位于胞质。给予不同浓度CoCl2，人为制造细胞低氧刺激，发现低氧时，CacyBP/SIP可发生核转位现象，Western blot亦证实CacyBP/SIP在刺激前位于胞质，刺激后部份位于胞核。

蛋白在细胞中的定位常常与其功能密切相关，很多蛋白分子从无活性形式变为活性形式时，会发生分子定位的变化，进入到特定的亚细胞结构中发挥其功能。CacyBP/SIP在给予刺激后发生核转位及磷酸化，提示其可能做为信号分子传递信息，从而参与细胞功能的调节。前期已发现CacyBP/SIP在结肠癌中高表达，免疫组化结果提示CacyBP/SIP位于胞浆及胞核，低氧可诱导CacyBP/SIP核转位，CacyBP/SIP是否做为信使，传递上游促进恶性肿瘤增殖的信号，需进一步研究。

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