载脂蛋白M可能经NF-κB介导大鼠肾缺血再灌注损伤

唐 华，张春梅，陈 蓉，黄 珀，万 英，曾维诚

(泸州医学院1.病理生理学教研室;2.医学机能学实验室，四川泸州646000)

载脂蛋白M(apolipoprotein M，APOM)是最近发现的一种新型载脂蛋白，主要在肝细胞和肾小管上皮细胞特异性表达［1－2］。肝脏表达的APOM可能与血脂的代谢与转运相关［3］，而肾脏表达APOM的生理意义尚不明确。肝细胞核因子1α(hepatic nuclear factor-1α，HNF-1α)、肝 X 受体(hepatic X receptor，HXR)等炎性相关转录因子能调节APOM在体内或体外 HepG2细胞的表达［4－7］，表明 APOM 可能参与炎性反应，但炎性反应的关键转录因子NF-кB与APOM的关系目前尚不清楚。

肾脏缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)在临床上常见于失血或中毒性休克及肾移植等，是决定移植肾存活和患者生存率的主要因素之一。据报道，由NF-кB介导的炎性级联反应在肾IRI过程中发挥重要作用［8］。本研究采用肾缺血再灌注大鼠模型，分别从基因和蛋白水平检测肾组织APOM的表达及NF-кB抑制剂——吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamat，PDTC)对 APOM 表达的影响，旨在探讨APOM参与肾IRI的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验分组和标本采集

清洁级75只250～300 g雄性SD大鼠［泸州医学院动物实验中心提供，合格证号:SCYK(川)2006-0004］随机分为3组:假手术组、肾缺血再灌注模型(IRI)组和PDTC干预组(IRI+PDTC)，各组按取材时间又分为再灌注3、6、12、24和48 h组，每组5只。肾 IRI模型按常规制作［9］，PDTC 组在术前0.5 h腹腔注射PDTC(Sigma公司)100 mg/kg，假手术组和IRI组注射等量0.9%氯化钠注射液。于再灌注各时间点再次开腹，下腔静脉取血3 mL用于检测血肌酐(creatinine，Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN);同时切除左肾，分离肾皮质用于提取总RNA、胞质蛋白和核蛋白;其余肾组织常规制片，HE染色观察肾脏病理改变。

1.2 实时荧光定量PCR检测APOM mRNA的表达

用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA，反转录成cDNA。引物(上海晶美生物技术有限公司合成)如下:上游引物 5'-ACAAAGAGACCCCAGA GCCC-3'，下游引物 5'-TCCATGGTGGGAGCCG-3'，片段长度67 bp;以 β-actin为内参照，上游引物5'-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3'，下游引物 5'-CAA GAAGGAAGGCTGGAAAAGA-3'，片 段 长 度 71 bp。PCR 反 应 采 用 20 μL 体 系，内 含 2 μL cDNA，22.5 pmol上游引物和下游引物，5 pmol探针，10 mmol/L dNTP 2 μL和1单位 Tag DNA聚合酶。扩增条件:95℃ 预变性1 min;95℃ 5 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s，45个循环。反应在Light Cycler仪上进行(Roche公司生产)。采用 2－△△CT(△CT值 =CT，APOM－ CT，β-actin，△△CT值 = △CT，各处理组－△CT，假手术组)表示各组 APOM mRNA 通过 β-actin 均一化处理后相对于假手术组的表达量。

1.3 Western blot检测APOM和NF-кB P65蛋白表达

提取的胞质蛋白和核蛋白，BCA法定量。分离胶浓度12%，浓缩胶浓度6%，蛋白上样量10 μg。泳毕，将蛋白电转移至PVDF膜，用含5%BSA的1×TBST(1×TBS+1%Tween+5%BSA，pH 7.6)封闭过夜，加入一抗［APOM兔抗人多克隆抗体由瑞典隆德大学临床化学研究所惠赠，稀释浓度1∶10 000;NF-кB P65和β-actin兔抗大鼠多克隆抗体(Santacruz公司)，稀释浓度1∶800］，37 ℃孵育2 h;加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(Santa-cruz公司，稀释浓度1∶2 000)，37℃孵育1.5 h;以 β-actin为内参照，用ECL Plus kit(Pierce公司)进行化学发光，最后用凝胶成像系统(Bio-Rad公司)自动曝光、扫描。蛋白相对表达量 =INT'各处理组/INT'假手术组，INT'=INT目的蛋白/INTβ-actin。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 肾功能和组织学检查

Cr和BUN水平的变化趋势相似。IRI组各时间点Cr及BUN水平均较假手术组显著增高(P＜0.01);而PDTC组Cr及BUN水平较IRI组明显降低(P＜0.05，P＜0.01)，但仍然高于假手术组(P＜0.05)。IRI和PDTC组随着再灌注时间的延长，Cr及BUN水平均逐渐增高(图1)。

假手术组肾脏组织结构正常，IRI组肾脏病理变化明显，镜下见肾小管上皮细胞空泡变性、坏死、脱落，管腔内各种管型，肾间质炎性细胞浸润。PDTC组肾脏病变比IRI组明显减轻(图2)。

2.2 肾皮质APOM mRNA的表达

假手术组有少量 APOM mRNA表达。IRI和PDTC组APOM mRNA水平均较假手术组显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，但与IRI组同一时间点比较，PDTC组各组APOM mRNA水平均明显降低(P＜0.01)。

IRI和PDTC组APOM mRNA表达呈现出同样的变化规律，均在再灌注3 h表达增强，于6、12 h表达缓慢下降，并在12～48 h表达再次上调(图3)。

2.3 肾皮质APOM和NF-кB P65蛋白表达

IRI组APOM和NF-кB P65蛋白的表达均较假手术组明显增高，PDTC组两种蛋白的表达均比IRI组显著降低(P＜0.01)。在IRI和PDTC组两种蛋白的表达趋势均呈双峰型改变。APOM的表达高峰出现在再灌注6和48 h;而NF-кB P65的表达高峰在再灌注3和48 h(图4)。

经检验，APOM mRNA与 NF-кB P65的表达符合直线正相关(r=0.852，P＜0.01)，APOM mRNA相对NF-кB P65表达的直线回归方程拟合为y=1.687x－0.342。

3 讨论

作为一种新型载脂蛋白，APOM参与脂代谢的功能正在被逐步阐明。APOM主要在肝和肾表达。在肝癌［10］及肝 IRI［11］中 APOM 表达发生明显变化，但在肾IRI时APOM表达的变化目前尚无报道。本研究发现，IRI组各时间点肾皮质APOM mRNA表达均明显高于假手术组，再灌注3 h表达达到高峰，6及12 h表达下调，从24～48 h表达再次增高。APOM蛋白的表达同样呈现双峰型改变，但表达高峰滞后于mRNA。可见，肾IRI时APOM表达发生了明显改变，提示APOM参与了肾IRI的发病过程。

人类APOM基因位于6号染色体主要组织相容性复活体MHCⅢ区，毗邻TNF-α和淋巴毒素基因，此区大多数基因均与免疫炎性反应有关［12］。APOM能被某些炎性反应相关转录因子调节，例如HNF-1α能上调HepG2细胞和活体肝癌组织APOM的表达［4－5］;而 HXR 激动剂则明显抑制活体和体外APOM mRNA 水平［6－7］。因此，APOM 可能与炎性免疫反应有关。

NF-кB是一种快速反应的转录调节因子，可通过多条信号传导通路调控多种炎性反应相关基因的转录，在炎性反应免疫性疾病中发挥重要作用［13］。本研究应用TFSEARCH在线分析发现APOM基因启动子区存在类NF-кB结合位点，结合本实验结果，NF-кB的活性改变在观察时间内同样呈双峰型趋势，于再灌注3 h达高峰，6及12 h活性下降，并于12 h直到48 h再次增高。且随着IRI组NF-кB活性的增高，APOM的表达也显著增高;而PDTC组伴随NF-кB活性降低，APOM的表达也下调。APOM的表达相对NF-кB活性的直线回归方程拟合良好，两者的相关系数较高。提示APOM的表达变化与NF-кB的活性改变有关，其两次高峰可能分别由IRI的应激性损伤和炎性级联反应所致。

图3 各组肾皮质APOM mRNA表达水平Fig 3 APOM mRNA levels in renal cortex of all groups(x ± s，n=5)

图4 Western blot检测各组肾皮质APOM和细胞核内NF-κB P65蛋白表达Fig 4 Expression of APOM and NF-κB P65 protein in renal cortex detected by Western blot(x ± s，n=5)

已经发现的IRI发病机制很多，其中由 NF-кB介导的炎性反应在其发病中起着重要作用。本研究初步表明，APOM可能是NF-кB的下游反应元件之一，其基因转录和表达受某种NF-кB信号传导通路的调控，从而通过NF-кB调控的炎性反应，参与肾IRI的发病。NF-кB信号传导通路是直接调控APOM的表达，还是通过间接途径影响，还需对NF-кB与APOM基因启动子区相应位点的结合及其具体的细胞内信号传导途径做进一步探讨。

志谢:感谢瑞典隆德大学临床化学研究所徐宁博士、苏州大学附属第三医院张晓膺教授和综合实验室罗光华老师在技术上的大力支持和帮助！

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