初发性类风湿关节炎患者外周血中Tfh细胞及其相关细胞因子的临床意义

徐 琦，程路峰，孟 岩，付 伟，杨 昭，丁剑冰*，罗 莉*

(新疆医科大学1.基础医学院;2.公共卫生与预防医学博士后流动站;3.第一附属医院风湿科，新疆乌鲁木齐830011)

滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cells，Tfh细胞)是近年来新发现的，真正意义上辅助B细胞功能的T细胞亚群，其辅助B细胞活化、增殖、分化和分泌免疫球蛋白［1］。在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)中，B细胞分泌大量高亲和力抗体可诱发炎性反应，致关节损伤［2］。本实验拟通过对RA患者外周血Tfh细胞表型及相关细胞因子的检测，探讨其与初发性RA发病的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象及主要试剂

1.1.1 研究对象:RA组:新疆医科大学第一附属医院风湿科初次就诊患者，符合1987年美国风湿病学会(ACR)RA诊断标准。对照组:为健康志愿者。各组均签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂:FITC标记的抗CXCR5，CD3抗体;PE标记的抗CD8、CD3抗体;PerCP标记的抗CD4抗体、PE-cy7标记的抗 ICOS抗体以及同型对照(Becton Dickinson公司)。ELISA试剂盒(R＆D公司)。

1.2 免疫荧光标记和流式细胞术检测:抗凝外周血100 μL，分别加入FITC标记的抗CXCR5，PE标记的抗CD3，PerCP标记的抗CD4，PE-cy7标记的抗 ICOS抗体各20 μL或者 FITC标记的CD3，PE标记的 CD8和PerCP标记的 CD4抗体各20 μL，按规程操作。分析Th/Tc细胞，先以CD3+细胞设门分群后，分析CD4+、CD8+细胞百分率(图1)。Tfh细胞分析，以FSC/SSC设门，得到CD3+CD4+细胞，进而分析ICOS和CXCR5的表达(图2)。

1.3 血清学指标检测:按照ELISA试剂盒操作步骤检测，酶标仪检测450 nm处的吸光度(A)值。

1.4 统计学分析:数据采用SPSS14.0统计软件处理。数据以均数±标准差(±s)表示，根据方差齐性检验结果，两组间比较采用独立样本t检验，不同指标之间进行Spearman相关分析。

2 结果

2.1 RA组和对照组Th/Tc细胞、CD3+CD4+CXCR5+ICOS+T细胞百分率比较:RA组CD3+CD4+T细胞百分率与对照组无显著性差异，但 RA组 Th/Tc的比值低于对照组(P＜0.05)。RA患者CD3+CD4+CXCR5+Tfh的数量与正常对照相比较明显增多(P＜0.05)(表1);CD3+CD4+ICOS+T细胞数量在患有RA后未见明显增加，但CD3+CD4+ICOS+CXCR5+T细胞的数量显著增加。

2.2 细胞因子水平的比较:RA组IL-21和TGF-β水平分别为512.80±79.83 ng/L和659.13±184.20 ng/L，显著高于对照组的340.24±45.05 ng/L和401.17±139.64 ng/L(P＜0.01);IL-4水平由对照组的680±76.83 ng/L降至RA组的320±56.83 ng/L(P＜0.01)。

表1 RA组和对照组T细胞亚群的比较Table 1 Comparison of T cell subset between control and RA group

2.3 RA患者外周血Tfh及细胞因子与临床指标相关性分析:RA患者Tfh细胞百分率、IL-21水平与疾病DAS28评分、ESR、CRP、CCP 和 RF 正相关(r分别为 0.67，0.49，0.38，0.21和0.59，P＜0.05)，与疾病的病程及关节肿胀指数无相关性。RA患者TGF-β水平升高而IL-4水平降低，但两者与疾病活动度均无相关性。

3 讨论

RA患者存在细胞/体液免疫功能的紊乱，活化Th1细胞释放的细胞因子如IL-2等可以促进CD8+Tc细胞的增殖，使临床RA患者外周血中CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比例失衡，从而导致炎性反应。同时，由于Th2细胞功能的抑制，导致血清中IL-4水平的降低，对IL-21促进B细胞分化产生抗体拮抗作用的减弱会进一步加重炎性反应。另外，由于Tfh细胞的比例增加，可促进IL-21的产生，并刺激B细胞活化，加之TGF-β的协同作用，可能导致了机体分泌病理性自身抗体，从而诱发炎性反应。由于IL-21还可以来源于的Th17，因此IL-21的升高，还应考虑Th17的作用［3］。本研究仅分析RA患者外周血中Tfh细胞和IL-21的水平，并没有对RA患者体内Tfh细胞进行分离培养，检测其分泌IL-21的能力。因此对RA患者体内T细胞亚群的失调及相关细胞因子参与免疫调节功能的机制还有待进一步研究。

［1］Ma CS，Deenick EK，Batten M，et al．The origins，function，and regulation of T follicular helper cells［J］．J Exp Med，2012，209:1241－1253．

［2］Leandro MJ，Becerra-Fernandez E．B-cell therapies in established rheumatoid arthritis［J］．Best Pract Res Clin Rheumatol．2011，25:535 －548．

［3］Lina C，Conghua W，Nan L，et al．Combined treatment of etanercept and MTX reverses Th1/Th2，Th17/Treg imbalance in patients with rheumatoid arthritis［J］．J Clin Immunol，2011，31:596 －605．