NF-κB和AP-1在胶原性关节炎小鼠滑膜组织中的表达及活性升高

罗心静，莫选荣，周玲玲

(台州学院医学院生理学教研室，浙江台州318000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以累及周围关节为主要表现的系统性自身免疫病。炎性细胞因子过度表达是导致RA滑膜炎症和骨质破坏的重要因素。而在炎性介质的表达调节中，核转录因子Kappa B(nuclear factor κB，NF-κB)和激活蛋白 1(activator protein-1，AP-1)被认为是最重要的转录调控分子，它们的表达和活性增加可促进炎性细胞因子的生成［1－2］。本研究观察了胶原性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)小鼠滑膜中 NF-κB 和 AP-1表达及活性变化，以探讨RA病变的机制。

1 材料与方法

1.1 动物:清洁级雄性DBA/1小鼠20只，年龄8～10周(上海实验动物中心)，正常饲养。

1.2 试剂:牛II型胶原(Chondrex公司);完全福氏佐剂(CFA)或不完全福氏佐剂(FIA)(Sigma公司);TNF-α和IL-6酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(博士德公司);抗AP-1(fos)抗体和抗NF-κB(P65)抗体(Cell signal公司);电泳迁移率分析(EMSA)试剂盒(Pierce公司);AP-1寡核苷酸探针(5'-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3')、NF-κB 寡核苷酸探针(5'-AGTTGA GGGGACTTTCCCAGGC-3')由上海英俊公司合成。

1.3 分组和造模:将小鼠随机分成正常对照组和CIA模型实验组。CIA模型制备参照文献［3］。初次免疫30 d后处死小鼠，心脏取血，分离血清，并取左后足跖趾关节连续冰冻切片。

1.4 细胞因子检测:小鼠血清中 TNF-α、IL-6的含量用ELISA法检测，具体操作按ELISA试剂盒说明书进行。

1.5 免疫组化法检测NF-κB和AP-1表达:石蜡切片脱蜡水化;蒸馏水冲洗后于3%H2O2孵育10 min，PBS洗后微波法修复抗原，滴加封闭血清，室温孵育20 min;滴加适当稀释抗NF-KB(P65)或抗AP-1(fos)抗体，37℃孵育2 h;PBS冲洗后滴加生物素标记的二抗，37℃孵育15 min;PBS冲洗后滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育15 min;PBS冲洗后滴加DBA显色。冲洗后苏木素复染，中性树胶封片。图片分析仪进行图片分析，测定平均吸光度值。

1.6 EMSA检测NF-κB和AP-1的活性:分离滑膜组织核蛋白，按Pierce公司试剂盒说明书检测NF-κB和AP-1的DNA结合活性。

1.7 统计学分析:采用SPSS 13.0软件包处理，实验结果以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用t检验分析。

2 结果

2.1 血清中TNF-α和IL-6表达水平的检测:CIA小鼠血清中TNF-α和IL-6水平明显高于对照组［(750.5±45.6)ng/L vs(203.6±32.3)ng/L和(93.1±8.8)ng/L vs(26.8±5.2)ng/L］(P ＜0.05)。

2.2 滑膜组织中AP-1和NF-κB表达的检测:CIA小鼠关节滑膜中NF-κB阳性染色程度明显强于正常对照组(P＜0.05);AP-1阳性染色程度也明显强于正常对照组(P＜0.05);阳性细胞分布于滑膜衬里层，胞质及胞核内均有染色，但胞核染色较深(图1，表1)。

表1 CIA小鼠和正常对照小鼠NF-κB(P65)和AP-1(c-fos)的表达Table 1 The expression of NF-κB(P65)and AP-1(c-fos)in control and CIA mice(x ± s，n=10)

2.3 滑膜组织中AP-1和NF-κB的活性检测:CIA小鼠关节滑膜中 NF-КB DNA结合活性明显高于正常对照组，AP-1 DNA结合活性也显著高于正常对照组(图2)。

图1 CIA小鼠和正常对照小鼠NF-κB(P65)和AP-1(c-fos)的表达Fig 1 The expression of NF-κB(P65)and AP-1(c-fos)in control and CIA mice(SP，×400)

图2 CIA小鼠和正常对照小鼠NF-κB(P65)和AP-1(c-fos)的DNA结合活性Fig 2 The DNA binding activity of NF-κB(P65)and AP-1(c-fos)in control and CIA mice

3 讨论

炎性细胞因子在RA发病机制中起了重要作用，是使RA病变持续存在、迁延进展的关键因素。在RA的关节滑膜及关节液中，多种炎性细胞因子的表达显著增高，如TNF-α、IL-1和IL-6等，这些炎性细胞因子的异常表达可导致滑膜炎性反应和骨质破坏。尽管导致这些炎性细胞因子表达增加的机制目前尚未完全清楚，但核转录因子NF-κB和AP-1在炎性细胞因子表达中的作用已受到学者广泛的关注。

NF-κB是核转录因子，有文献报道在RA滑膜组织中NF-κB异常高表达，而且滑膜细胞遭受炎性因子刺激时NF-κB被活化［1］。本实验研究证实，CIA 小鼠滑膜中 NF-κB蛋白表达显著增加，NF-κB蛋白阳性细胞主要位于滑膜衬里细胞层，并且胞核染色明显强于胞质染色，同时CIA小鼠滑膜中NF-κB的DNA结合活性明显增强。提示在RA滑膜中，NF-κB在某些因素刺激下表达和活性增强，进而使炎性细胞因子过度表达，导致滑膜炎性反应和骨质破坏。

AP-1是炎性细胞因子刺激所活化的另一重要核转录因子［2］。为了探讨AP-1在RA病变中的作用，本研究采用免疫组织化学法和EMSA法对CIA小鼠滑膜中AP-1的表达和活化进行检测。结果发现CIA小鼠关节滑膜中AP-1蛋白表达增加，并且AP-1 DNA结合活性增强。AP-1的表达增加和活性增强可能与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路活化有关。活化的MAPK(包括P38、ERK、JNK等)可使 AP-1磷酸化而活性增强，促进炎性细胞因子的产生。

［1］Muller-Ladner U，Gay RE，Gay S．Role of nuclear factor kappaB in synovial inflammation［J］．Curr Rheumatol Rep，2002，4:201－207．

［2］ Peng SL．Transcription factors in autoimmune diseases［J］．Front Biosci，2008，13:4218 －4240．

［3］Luo X，Zuo X，Mo X，et al．Treatment with recombinant Hsp72 suppresses collagen-induced arthritis in mice［J］．Inflammation，2011，34:432 －439．