枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶的异源表达

刘 凯，刘逸寒，张 艳，田 耀，路福平

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶的异源表达

刘 凯，刘逸寒，张 艳，田 耀，路福平

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

以野生型枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增获得带有SD序列及谷氨酸棒状杆菌信号肽ΔS0949的BTG基因．将其与大肠杆菌–谷氨酸棒状杆菌穿梭表达载体pXMJ19连接，构建重组质粒pXMJ19-Sbtg转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13032．经IPTG诱导后该重组菌发酵液具有交联酪蛋白的能力，表明该重组菌能够实现分泌表达．

谷氨酰胺转氨酶；谷氨酸棒状杆菌；信号肽；分泌表达

谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，EC 2.3.2.13，简称TG或TGase)是一种催化酰基转移反应的转移酶．TG作为酰基受体与蛋白质中的赖氨酸残基的ε–氨基作用，形成ε–(γ–谷氨酰)Lys键，催化蛋白质分子内和分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解反应，从而改善蛋白质功能性质，提高蛋白质的营养价值，在肉制品、鱼类制品、豆制品、面食和乳制品等食品加工业以及纺织和生物制药等领域有着广泛的应用前景[1–6]．

目前，食品工业中谷氨酰胺转氨酶的主要生产方法是通过茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)直接发酵获得，由于酶活收率较低(仅为37%)[7]使其价格居高不下．虽然以日本的味之素公司科研人员为代表的中外学者对茂源链霉菌谷氨酰胺转氨酶(Streptomyces mobaraensis transglutaminase，MTG)进行了大量研究，发现使用谷氨酸棒状杆菌作为表达宿主，将MTG的酶原区基因和激活该酶原的蛋白酶基因同时转入宿主细胞后能够大量表达MTG[8–9]，之后不断研究通过分子生物学技术改进酶的活力，先后采用嵌合前肽替代自身前肽[10]、亲水表面热区区域趋向突变(WASH-ROM)理性进化和随机突变的非理性分子进化技术[11]，在提高酶的活力的同时，对酶的突变体的构效关系以及底物特异性进行了详细的分析，肯定了随机突变是提高酶比活力的有效手段，确定了影响酶活力的关键氨基酸．同时证明了C. ammoniagenes ATCC6872等棒状杆菌属微生物都是表达外源蛋白的良好宿主[12]，但MTG一些特性(诸如：pH和温度等)对一些加工底物和加工过程的需求不能很好满足[13]，使得开发不同种类和特性的TG成为食品加工业发展的一个必然趋势．而枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶(Bacillus subtilis transglutaminase，简称BTG)则能较好地弥补这些缺点．1996年日本的Kobayashi等[14]最早在枯草芽孢杆菌中发现了BTG，同时克隆出BTG基因，研究其分子结构，发现BTG没有信号肽．而Suzuki等通过对BTG进行分离和特性研究，证明该酶相对分子质量约为2.9×104，最适作用温度为60,℃，最适pH 8.2，能分别催化酪素液及BSA蛋白分子的交联和凝胶化[15]．关于BTG的研究目前主要以大肠杆菌(Escherichia coli)为表达宿主，主要存在表达量不高[16]，产物极易形成包涵体等问题，而关于该酶分泌表达的报道则极少．

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)目前主要用于工业化生产谷氨酸和赖氨酸等各类氨基酸[17]．以谷氨酸棒状杆菌作为表达宿主有着极其明显的优势：拥有一套高效的分泌信号肽及分子伴侣系统，转录翻译机制、遗传背景较清楚，从而能够高效分泌目的蛋白，也简化了目的蛋白的分离纯化，而且在多数情况下，谷氨酸棒状杆菌分泌的重组异源蛋白具有天然构象和生物活性[18]；谷氨酸棒状杆菌分泌的蛋白酶极少，几乎不会对表达的蛋白造成影响；谷氨酸棒状杆菌严格好氧，生长迅速，培养条件简单，使用安全，无致病性，作为表达宿主时间久，人们积累了极其丰富的发酵经验．这些都说明谷氨酸棒状杆菌是一种优良的食品用酶表达宿主．

本实验旨在通过构建谷氨酸棒状杆菌表达系统来实现BTG的分泌表达，为未来BTG的广泛应用奠定基础．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒

大肠杆菌(Escherichia coli)JM110、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCCA13032、野生型枯草芽孢杆菌(wild type Bacillus subtilis)、质粒pXMJ19均为本实验室保存．

1.1.2 主要试剂和工具酶

Taq DNA聚合酶、限制性内切酶HindⅢ和PstⅠ，Takala公司；DNA纯化回收和质粒快速提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；蛋白胨和酵母浸粉，Oxoid公司；其他试剂均为国产分析纯．

1.1.3 培养基

LB(Luria-Bertani)培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 5，pH 7.0．

LA培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 5，琼脂粉20，pH 7.0～7.2．

谷棒复苏培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 5，葡萄糖5，pH 7.0～7.2．

1.1.4 引物合成

根据GenBank中枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶基因序列(登录号为：E13095)，参考谷氨酸棒状杆菌信号肽筛选的结果[19]，设计一段含SD序列及全长信号肽序列ΔS0949的BTG基因，该信号肽为Keiro W等在野生型谷氨酸棒状杆菌基因组中筛选出的具有高效分泌能力的信号肽0949的基础上，通过优化切割位点的首个氨基酸，将原始信号肽的首个氨基酸亮氨酸(L)改为谷氨酰胺(Q)得到的．引物设计为：上游引物P1：5′-TATCGGCGCTGCCAGCATGTTTAT GCCAAAGGCCAACGCCCAAGGAGCATCGAGAT GATTATTGTATCAGGACAA-3′，上游引物P2：5′-CCCAAGCTTAAAGGAGGACACGCATGCAAATA AACCGCCGAGGCTTCTTAAAAGCCACCGCAG GACTTGCCACTATCGGCGCTGCCAG-3′，下游引物P3：5′-AAAACTGCAGTTAGCGGACGATGCG-3′.上游引物P1除互补序列外还含有信号肽序列ΔS0949的下游49个碱基序列，上游引物P2的5′端引入了HindⅢ酶切位点(AAGCTT)，含有信号肽序列ΔS0949的上游50个碱基序列及全长SD序列；下游引物P3的5′端引入了PstⅠ酶切位点(CTGCAG).引物委托上海英俊生物工程有限公司合成．

1.2 方法

1.2.1 野生型枯草芽孢杆菌染色体DNA的提取

接1环枯草芽孢杆菌单菌落于5,mL LB液体培养基，180,r/min、37,℃培养过夜；取1,mL菌液于1.5,mL的EP管中，离心去上清液，用500,µL去离子水重悬菌体，加溶菌酶至终质量浓度50,µg/mL，37,℃放置30,min；加10% SDS 100,µL，混匀，放置10,min左右直至黏稠；然后加入5,mol/L NaCl 100,µL，充分混匀，放置10,min；再加入体积比为1﹕1的苯酚与氯仿混合溶液700,µL，剧烈振荡，离心10,min；直至两界面澄清．用2倍体积无水乙醇沉淀DNA，12,000,r/min离心10,min，弃上清液，充分晾干；然后加50,µL去离子水溶解DNA，–20,℃保存备用．

1.2.2 含SD序列及信号肽ΔS0949的btg基因扩增

以野生型枯草芽孢杆菌染色体为模板，首先用引物P1、P3扩增目的基因，然后以该扩增产物为模板，以P2、P3为引物扩增出含SD序列及全长信号肽序列ΔS0949的BTG基因；扩增循环条件：95,℃预变性5,min，94,℃变性30,s，65,℃退火30,s，72,℃延伸1,min，30个循环．

1.2.3 重组质粒的构建

PCR产物纯化回收后用HindⅢ和PstⅠ双切后与同样经过HindⅢ和PstⅠ双切的质粒pXMJ19连接，转化E. coli JM110，涂布含氯霉素质量浓度为50,µg/mL的平板，挑取转化子，提取质粒，酶切验证，实验流程如图1所示．

图1 重组质粒pXMJ19-Sbtg构建流程图Fig. 1 Construction of pXMJ19-Sbtg

1.2.4 谷氨酸棒状杆菌的电转化

接种新鲜的对数期菌液至含0.1%吐温80和3%甘氨酸的LB液体培养基中，培养至A600约为0.9时取出摇瓶，冰浴15,min，4,℃、8,000,r/min离心10,min．用预冷的10%甘油洗涤菌体4次，最后用10%甘油重悬菌体，分装保存．取50,μL感受态细胞和2,μL构建好的重组质粒混匀，迅速加入预冷的电转杯中电击．电击条件为电压2.5,kV，电阻400,Ω，电容200,μF．电击结束后迅速取出电转杯，加入LB培养基1,mL，46,℃热击6,min，30,℃振荡培养1,h，取200,μL涂布于含10,μg/mL氯霉素的LB抗性平板．挑取转化子酶切验证．

1.2.5 目的基因在谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中的表达

接1环重组菌单菌落于装有50,mL LB培养基的250,mL三角瓶中，30,℃、200,r/min振荡培养过夜，以1%的接种量转接于装有100,mL LB培养基的500,mL三角瓶中，30,℃、200,r/min振荡培养8,h，加入终浓度为1,mmol/L的IPTG诱导目的蛋白的表达，继续培养48,h．发酵液于12,000,r/min离心5,min，取1,mL上清液，向其中加入100%TCA 130,μL，–20,℃放置30,min，4,℃沉淀12,h，12,000,r/min离心5,min，弃去上清液，加1,mL丙酮洗涤，待丙酮挥发完全后向沉淀中加入30 μL电泳上样缓冲液，沸水浴5,min，12,000,r/min离心10,min，取上清液进行SDS-PAGE分析．

1.2.6 酪蛋白交联实验

用0.1,mol/L Tris·Cl(pH 7.5)配制1,mg/mL酪蛋白溶液．将酪蛋白溶液与粗酶液按一定比例混合，再加入DTT至终浓度为5,mmol/L，于37,℃反应过夜．反应产物进行SDS-PAGE检测．

2 结果与分析

2.1 重组表达载体的构建

以野生型枯草芽孢杆菌染色体为模板，分别用引物P1、P3和P2、P3扩增目的基因Sbtg．由于在引物合成过程中，在btg的上游外源添加了一段SD序列和谷氨酸棒状杆菌的高效分泌信号肽序列ΔS0949，使得btg具有了在谷氨酸棒状杆菌中能够分泌表达的潜力．PCR产物纯化回收后用HindⅢ和PstⅠ双切，后与同样经过HindⅢ和PstⅠ双切的质粒pXMJ19连接，转化E. coli JM110，涂布含氯霉素质量浓度为50,µg/mL的平板，挑取转化子，提取质粒，酶切验证(图2)．经HindⅢ和PstⅠ双切，重组质粒产生6,600,bp和850,bp的两条带，与预计大小相符，表明重组质粒构建成功．

2.2 谷氨酸棒状杆菌的电转化及鉴定

鉴于谷氨酸棒状杆菌具有非常强的限制系统，能有效降解来自不同菌种的异源 DNA或被异源甲基化修饰的 DNA，使得在普通大肠杆菌中构建的重组DNA对谷氨酸棒状杆菌的电转化效率不高，因此，首先在甲基化修饰缺陷系统的大肠杆菌菌株JM110中构建好重组质粒pXMJ19-Sbtg，利用该质粒的大肠杆菌–谷氨酸棒状杆菌穿梭特性转化谷氨酸棒状杆菌，可提高其转化效率．提取JM110中构建好的质粒，转化ATCC13032感受态细胞，涂布于含氯霉素10,µg/ mL 的LA抗性平板．挑取转化子酶切验证．

图2 重组质粒的酶切鉴定Fig. 2 Idenfication of recombined vector by digestion with HindⅢ and PstⅠ

2.3 重组菌pXMJ19-Sbtg/13032的诱导表达

将未诱导及诱导48,h后的重组菌株和对照菌株pXMJ19/13032发酵液进行SDS-PAGE(图3)．通过测序结果推测，目的蛋白的相对分子质量应该为2.7×104，但电泳结果显示，重组菌株pXMJ19-Sbtg/13032及对照菌株pXMJ19/13032均未见明显的目的条带出现，推测原因：活性形式的BTG由于其交联作用会对菌体产生毒害作用，导致该蛋白的表达量不高．

图3 重组蛋白的SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE analysis of the recombined protein

2.4 酪蛋白交联实验

分别将诱导前后重组菌及对照菌pXMJ19/13032发酵液过滤除菌后与配制的酪蛋白溶液混合，37,℃反应过夜后可见重组菌发酵液变浑浊，有白色絮状沉淀产生，而对照菌发酵液则依然为澄清状态．取反应液SDS-PAGE分析(图4)，结果表明与重组菌发酵液混合的酪蛋白经过BTG的交联作用产生相对分子质量极大的聚合体，该聚合体无法进入浓缩胶内，而对照菌则未发生交联反应．这表明重组菌经诱导后BTG得到了表达．

图4 酪蛋白交联产物SDS-PAGEFig. 4 SDS-PAGE analysis of cross-linked polymer

3 结 语

枯草芽孢杆菌谷氨酰胺转氨酶(BTG)作为谷氨酰胺转氨酶家族中较为特殊的一种，由于其相对分子质量较小(约2.8×104)及比活力较高，从而具有巨大的潜在应用价值．大肠杆菌由于产内毒素和易形成包涵体等局限，无法达到食品级用酶严格的生产要求，而谷氨酸棒状杆菌则无此局限，是生产该酶潜在的优良宿主．由于天然存在的BTG是胞内酶，不含信号肽序列，无法得到分泌表达，故参阅相关文献，利用一段适于谷氨酸棒状杆菌高效分泌表达的信号肽序列ΔS0949，将其与BTG基因连接，得到了能分泌表达BTG的重组谷氨酸棒状杆菌．目前还没有关于特异性测定BTG酶活的方法，而氧肟酸比色法[20]是测定茂源链霉菌谷氨酰胺转氨酶酶活的特异方法，但无法使用该方法测出BTG的酶活，推测可能原因为不同来源的谷氨酰胺转氨酶的底物要求不同造成的，寻找特异性底物对BTG的表达量进行定量分析成为下一步工作的重点．

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责任编辑：郎婧

Heterogeneous Expression of Bacillus subtilis Transglutaminase

LIU Kai，LIU Yihan，ZHANG Yan，TIAN Yao，LU Fuping
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

GeneSbtgwith SD sequence and signal peptide ΔS0949Corynebacterium glutamicumwas obtained from the genomic DNA of wild typeBacillus subtilisthough PCR amplification. It was then inserted into anE. coli-C. glutamicumshuttle vector pXMJ19 to construct expression plasmid pXMJ19-Sbtg. The recombined plasmid was then transformed intoCorynebacterium glutamicumATCC13032. Induced by IPTG，the fermentatiom broth had a cross-linking ability. The result indicated that gene Sbtg was a secretion expression.

transglutaminase；Corynebacterium glutamicum；signal peptide；secretion expression

Q814.4

：A

：1672-6510(2012)03-0001-05

2011–12–16；

2012–01–22

“863”“十二五”农村领域国家科技计划课题资助(2011AA100905-4)；国家自然科学基金资助项目(21076159)

刘 凯（1986—），男，山东泰安人，硕士研究生；通信作者：路福平，教授，lfp@tust.edu.cn．