ABCA1基因V825I多态性与腔隙性脑梗死合并高血压病的相关性研究1）

薛偕华，黄赛娥，吴加勇，洪江从，林志诚，林高城，吴成翰

ATP结合盒转运子A1（ATP binding cassette transporter 1，ABCA1）是一种整合膜蛋白，它以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出，后者结合到细胞表面的载脂蛋白A1（apoH1），形成新生的高密度脂蛋白胆固醇（HDL－C），参与胆固醇逆向转运而发挥抗动脉粥样硬化的作用。研究表明ABCA1基因变异导致HDL－C缺陷伴早发动脉粥样硬化［1］。近来有大量文献表明，ABCA1基因单核苷酸多态性（SNP）与血浆脂质水平和动脉粥样硬化易感性有着密切的相关性［2－5］。V825I是ABCA1基因编码区17号外显子的一个SNP位点，在第六个跨膜结构的α螺旋中由GTC变异为ATC，可能对ABCA1蛋白活性产生影响。V825I与缺血性心脏病及血脂的研究较多，在不同的人群结果往往不一致［6－11］，而且V825I在腔隙性脑梗死合并高血压病的研究尚未见报道。因此，本研究采用病例对照研究方式探讨V825I多态与腔隙性脑梗死合并高血压病的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 病例来源于2008年9月—2011年6月在福建中医药大学附属第二人民医院住院部和门诊的腔隙性脑梗死伴高血压病患者。病例组共97例，男61例，女36例；年龄48岁～83岁（67.7岁±10.5岁）。腔隙性脑梗死严格按照1990年脑血管病Ⅲ的标准诊断［12］。所有病例都经磁共振成像（MRI）或CT平扫证实。对照组129例，为福建中医药大学附属第二人民医院体检中心的无高血压病及无心脑血管疾病人群，其中男77例，女52例，年龄43岁～80岁（59.2岁±9.6岁）。观察对象均排除肝、肾、内分泌等影响脂质代谢的疾病、心房纤颤、周围血管疾病、大动脉炎、血液病、结核、恶性肿瘤及入院前2周内使用降脂等药物者。在收集血液标本的同时，收集每个研究对象详细的人口学资料。两组均为福建省汉族人，无血缘关系。以上研究对象均进行血糖、血脂、血压等检查，高血压病的诊断标准为血压≥140／90mmHg（1mmHg＝0.133kPa），糖尿病的诊断标准为空腹血糖≥7.0mmol／L或餐后2h血糖≥11.1mmol／L。

1.2 生化检测 空腹12h后采取外周静脉血，分离血清。全自动生化分析仪测定总胆固醇（TC）、三酰甘油 （TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL－C）、HDL－C、apoA1及血糖。

1.3 基因组DNA提取和PCR扩增 空腹抽取静脉血2mL以ACD抗凝，以外周血基因组DNA提取试剂盒（QIAGENE）提取。反应使用9700型PCR扩增仪，体系25μL。含有大约100ng基因组 DNA，50pmol／μL上下游引物0.5μL（引物：F 5’－ gAgACTgACCAggAAATgg －3’R 5’－ ATgCACTg－CAgAgATTCTAg－3’），20mmol／L dNTP 0.5μL，10×PCR缓冲液2.5μL，TaqDNA聚合酶1.25U，用去离子水补至25 μL。扩增程序为：94℃预变性2min，然后94℃变性30s，61℃退火45s，72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃延伸5 min。17号外显子V825I位点的PCR产物用限制性内切酶BsaI（NEB公司）于50℃酶切过夜，反应体系为20μL：PCR反应产物8μL，内切酶2U，NEBuffer3 2μL，去离子水补至20 μL。酶切产物在3%琼脂糖凝胶中进行电泳，溴乙啶染色，紫外灯下观察电泳结果并确定基因型，D2000有100bp到2000bp作为标记。

1.4 统计学处理 以χ2检验验证入选人群是否符合Hardy－Weinberg遗传平衡定律以及各组的基因型频率和等位基因频率，以χ2检验或Student’st检验比较人口学特征，吸烟、饮酒状况，血脂水平等。多因素Logistic回归计算比值比（odds ratios，OR）及其95%可信区限（confidence intervals，CI）表示相对风险度。所有的统计检验均为双侧概率检验。统计软件为SPSS11.5版。

2 结 果

2.1 两组基础资料比较 两组性别、酒精摄入、吸烟、TC、TG和LDL－C差异均无统计学意义。但病例组患者年龄高于对照组，血浆TC、HDL－C和apoA1水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 两组基础资料比较

2.2 基因型频率和等位基因频率分布情况 V825I多态性位点的PCR扩增产物长330bp，经BsaI酶切后，V等位基因被切为184bp和164bp两个片段，而I等位基因由于无酶切位点仍为一个330bp的片段，所以VV基因型含有184bp和164bp两个片段，Ⅵ基因型含有330bp和184bp、146bp三个片段，Ⅱ基因型仅有330bp一个片段。ABCA1基因V825I各组人群经Hardy－Weinberg遗传平衡定律检验差异无统计学意义（P＞0.05），说明具有人群代表性。基因型及等位基因频率分布情况见表2。ABCA1基因V825I位点基因型频率在病例组与对照组比较分布差异有统计学意义（χ2＝7.22，P＜0.05），等位基因频率在两病例组与对照组分布差异也有统计学意义（χ2＝6.59，P＜0.05）。为了进一步阐明这种相关性，对年龄、性别、血脂水平、吸烟等危险因素进行校正行Logistic回归分析发现，与VV基因型比较，II基因型患病的风险显著降低（OR：0.31，95%CI：0.13～0.72）。

表2 基因型频率和等位基因频率分布 例（%）

2.3 V825I各基因型与血脂的相关分析（见表3） VV、VI、II三种基因型与各血脂成分TC、TG、LDL－C、HDL－C之间未见明显相关性。虽然apoA1水平在VV、VI、II三种基因型中有逐渐升高趋势，但差异仍无统计学意义。

表3 V825I多态不同基因型与血脂水平的关系（±s） mmol／L

表3 V825I多态不同基因型与血脂水平的关系（±s） mmol／L

血脂VV VI II TC 4.93±0.95 5.03±0.99 4.81±0.87 TG 1.53±0.87 1.82±0.92 1.80±0.90 LDL－C 3.07±0.83 3.06±0.82 2.97±0.71 HDL－C 1.17±0.29 1.21±0.28 1.17±0.36 apoA1 1.21±0.27 1.25±0.21 1.26±0.23

3 讨 论

ABCA1基因位于9q31，含有50个外显子，49个内含子。ABCA1基因上有多个SNP位点，研究表明多数SNP位点能影响血脂水平、动脉硬化的严重程度［7，8］。V825I是ABCA1基因编码区重要的SNP位点，其在欧洲人群的等位基因频率较低，丹麦825I等位基因频率为6%，荷兰为8.1%，北爱尔兰约为5.6%，而在亚洲人群825I等位基因频率在40%～50%。Cao等［13］研究表明，在中国广西汉族人群中825I等位基因频率分布为42.3%。在本研究中对照组的I等位基因频率分布为49.2%，VV、VI、II基因型频率分别为25.6%、50.4%、24.0%。目前对ABCA1基因V825I位点的研究主要集中在血脂水平及缺血性心脏病易感性方面，而且在不同的人群结果往往不相一致［6－11］。Frikke－Schmidt等［7］研究提示，在丹麦人群中825I携带者具有较高的HDL－C水平，Kyriakou等［8］对V825I位点的体外研究发现，与表达825V的细胞比较，表达825I的细胞对H3标记胆固醇的排出率较高，提示825I具有更强的ABCA1活性，其HDL－C生成水平较高。Tan等［6］报道V825I位点与新加坡的马来人群的缺血性心脏病具有相关性，与新加坡华人的血脂水平及心脏病易感性无明显关系。Clee等［4］研究提示V825I与血浆HDL－C的水平无明显相关，但是与缺血性心脏病的发病风险有显著相关。Li等［10］研究提示，中国汉族人群中V825I多态与apoA1的水平有关，这种相关性依赖于V825I和R1587K的单倍型的构成情况。而Cao等［13］研究表明，在中国广西汉族人群中V825I基因型与HDL－C、apoA1的水平相关。这种不一致的研究结果，V825I位点对血脂、疾病易感性的影响与人群种族、饮食、环境因素等密切相关。在本研究中发现腔隙性脑梗死伴高血压病患者V825I的基因型频率和等位基因频率与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），经Logistic回归分析表明，II基因型者患病的风险仅为VV基因型的0.31。而在基因型和血脂水平的关系研究中未见V825I与TC、TG、LDL－C、HDL－C的水平有关，这与Tan等研究结果一致。虽然apoA1的水平随VV、VI、II逐渐升高，但差异无统计学意义，有待扩大样本量进一步证实。同时本研究尚未对R1587K位点进行检测，未能进一步证实Li等研究结果。

在中国福建地区的汉族人群中，ABCA1基因V825I位点与腔隙性脑梗死合并高血压病有相关性，II基因型具有一定保护因素；V825I位点与血浆apoA1的关系有待在不同人群中和扩大样本数进一步证实。

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